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Síndrome de Bardet-Biedl y síndrome de Alström: caracterización molecular y propuesta de nuevos mecanismos.

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Síndrome de Bardet-Biedl y síndrome de Alström: caracterización molecular y propuesta de nuevos mecanismos.

Alvarez Satta, Maria
 
DATE : 2017-06-16
UNIVERSAL IDENTIFIER : http://hdl.handle.net/11093/746
UNESCO SUBJECT : 2410.07 Genética Humana ; 2409.92 Genética Molecular de Plantas ; 2409 Genética
DOCUMENT TYPE : doctoralThesis

ABSTRACT :

El síndrome de Bardet-Biedl (BBS) y el síndrome de Alström (ALMS) pertenecen al grupo de las ciliopatías, enfermedades producidas por anomalías estructurales y/ o funcionales del cilio primario, un orgánulo de localización ubicua en células eucariotas. El cilio primario se considera la antena sensorial de las células, destacando su papel como coordinador central de distintas rutas de señalización celular, esenciales para el correcto funcionamiento y homeostasis de los organismos. Las ciliopatías se caracterizan por una gran heterogeneidad genética y su solapamiento genético y fenotípico, lo cual complica enormemente un diagnóstico diferencial temprano de los pacientes. Dentro de este grupo de enfermedades, el BBS y el ALMS se consideran modelos para el estudio de numerosos procesos y enfermedades comunes. El BBS está causado por mutaciones en los genes BBS, habiéndose descrito hasta la fecha 21 genes implicados, mientras que el ALMS es un síndrome monogénico causado por mutaciones en el gen ALMS1; ambos síndromes presentan un alto grado de solapamiento fenotípico. El objetivo ... [+]
El síndrome de Bardet-Biedl (BBS) y el síndrome de Alström (ALMS) pertenecen al grupo de las ciliopatías, enfermedades producidas por anomalías estructurales y/ o funcionales del cilio primario, un orgánulo de localización ubicua en células eucariotas. El cilio primario se considera la antena sensorial de las células, destacando su papel como coordinador central de distintas rutas de señalización celular, esenciales para el correcto funcionamiento y homeostasis de los organismos. Las ciliopatías se caracterizan por una gran heterogeneidad genética y su solapamiento genético y fenotípico, lo cual complica enormemente un diagnóstico diferencial temprano de los pacientes. Dentro de este grupo de enfermedades, el BBS y el ALMS se consideran modelos para el estudio de numerosos procesos y enfermedades comunes. El BBS está causado por mutaciones en los genes BBS, habiéndose descrito hasta la fecha 21 genes implicados, mientras que el ALMS es un síndrome monogénico causado por mutaciones en el gen ALMS1; ambos síndromes presentan un alto grado de solapamiento fenotípico. El objetivo general de este proyecto de tesis es profundizar en las bases moleculares del BBS y el ALMS, explorando nuevos mecanismos que podrían estar implicados en su desarrollo para tratar de dar respuesta a la gran variabilidad clínica característica de estas dos ciliopatías. El proyecto se dividirá en dos fases principales: una primera etapa en la que se analizará la carga mutacional de distintos genes implicados y se caracterizarán las variantes encontradas a nivel bioinformático y funcional, y una segunda fase en la que se investigarán potenciales mecanismos no estudiados hasta el momento en relación a ambos síndromes que puedan vincularse a su desarrollo: Así, se valorará la carga mutacional de los genes del complejo CCT/BBS-chaperonina (BBS6-BBS10-BBS12) en pacientes BBS con resultado negativo para un cribado mutacional previo. Todas las variantes identificadas se analizarán con distintas herramientas bioinformáticas para predecir su potencial patogenicidad. A continuación, se seleccionarán algunas variantes, en estos u otros genes, para realizar estudios de minigene assay y así determinar si alteran el procesamiento de ARN mensajero a través de la simulación in vitro del mecanismo de splicing. Además, se intentará obtener toda la información clínica disponible de aquellos pacientes con mutaciones en BBS6-BBS10-BBS12 para establecer una correlación genotipo-fenotipo que ayude a orientar el diagnóstico molecular del BBS. Respecto al estudio de nuevos mecanismos, se realizarán dos aproximaciones. En primer lugar, se analizará la susceptibilidad de inactivación de promotores derivada de la presencia de metilación, ya que constituye la modificación epigenética más ampliamente estudiada y está asociada generalmente a un silenciamiento de la expresión génica. Para ello, se evaluará in silico la presencia de islas CpG en las regiones promotoras de genes BBS y ALMS1, así como de secuencias X-box (implicadas en la regulación transcripcional de genes ciliares) y factores de transcripción en estas islas. A continuación, se diseñará un procedimiento experimental mediante PCR cuantitativa específica de metilación para cuantificar el grado de metilación de estos promotores, utilizando controles celulares y muestras de pacientes. Finalmente, se plantea también el estudio de la posible relación entre el gen ALMS1 y la ruta de señalización TGF-β/BMP, coordinada por el cilio primario y clave en el control de procesos de proliferación y diferenciación, utilizando para ello modelos celulares silenciados para este gen mediante ARN de interferencia, y distintas técnicas experimentales como PCR cuantitativa en tiempo real, inmunofluorescencia y western blot. En función de los resultados obtenidos, se propone también la extensión de este estudio a genes BBS de interés. [-]
 
Bardet-Biedl syndrome (BBS) and Alström syndrome (ALMS) belong to the group of ciliopathies, which are disorders caused by structural and/or functional anomalies of primary cilium, a ubiquitous eukaryotic organelle. Primary cilium is considered the sensory antenna of cells due to its key role in coordinating the different cell signaling pathways, which are essential for maintaining organisms’ homeostasis. Ciliopathies have high genetic heterogeneity and also show genetic and clinical overlapping, which further complicate an early, differential diagnosis. BBS and ALMS are considered model ciliopathies to study a number of biological processes and common diseases. BBS is caused by mutations in BBS genes, which include 21 different genes, whereas ALMS is considered a monogenic disorder with only ALMS1 gene involved; both syndromes have many overlapping features. The global aim of this thesis project is further deepening molecular basis of BBS and ALMS and also exploring new mechanisms potentially involved in their development, trying to explain the characteristically phenotypic ... [+]
Bardet-Biedl syndrome (BBS) and Alström syndrome (ALMS) belong to the group of ciliopathies, which are disorders caused by structural and/or functional anomalies of primary cilium, a ubiquitous eukaryotic organelle. Primary cilium is considered the sensory antenna of cells due to its key role in coordinating the different cell signaling pathways, which are essential for maintaining organisms’ homeostasis. Ciliopathies have high genetic heterogeneity and also show genetic and clinical overlapping, which further complicate an early, differential diagnosis. BBS and ALMS are considered model ciliopathies to study a number of biological processes and common diseases. BBS is caused by mutations in BBS genes, which include 21 different genes, whereas ALMS is considered a monogenic disorder with only ALMS1 gene involved; both syndromes have many overlapping features. The global aim of this thesis project is further deepening molecular basis of BBS and ALMS and also exploring new mechanisms potentially involved in their development, trying to explain the characteristically phenotypic variability associated to them. This project is divided in two main phases: the first one consists of analyzing the mutational load of several causal genes and characterizing them with bioinformatics and functional tools. The second phase comprises the investigation of new mechanisms not considered to date with regard to both syndromes that could be linked to their development: Thus, the total mutational load of BBS6-BBS10-BBS12 genes, belonging to the CCT/BBS-chaperonin complex, will be evaluated in those BSB patients with negative results for a previous molecular screening. All the variants identified will be analyzed using different software tools to predict their potential pathogenicity. After that, several variants of different genes will be selected for functional analysis based on minigene assay, an in vitro simulation of splicing mechanism, trying to determine potential alterations of mRNA processing. In addition, all available clinical information of patients with mutations in BBS6-BBS10-BBS12 genes will be collected to establish a genotype-phenotype correlation that improves the molecular diagnosis of BBS. Regarding to the study of new mechanisms involved, two approaches will be considered. Firstly, the possible inactivation of promoters due to the presence of methylation will be assessed, since it represents the most extensively studied epigenetic modification and is often associated to gene expression silencing. For that purpose, we will search for CpG islands in promoter regions of BBS and ALMS1 genes, and also for X-box sequences (involved in transcriptional regulation of ciliary genes) and transcription factors located within the islands. Then, an experimental procedure will be designed to quantify the methylation degree of selected promoters in cell and patients samples, by methylation-specific quantitative PCR. Finally, the possible biological link between ALMS1 gene and the TGF-β/BMP signaling pathway, known to be coordinated by primary cilium and that has a key role in proliferation and differentiation, will be studied by using knockdown cell models with small interfering RNA and different techniques such as quantitative real-time PCR, immunofluorescence and western blot. According to our results, this research could be extended to some BBS genes of interest [-]
 
A síndrome de Bardet-Biedl (BBS) e a síndrome de Alström (ALMS) pertencen ó grupo das ciliopatías, enfermidades producidas por anomalías estruturais e/ou funcionais do cilio primario, un orgánulo de localización ubicua nas células eucariotas. O cilio primario considérase a antena sensorial das células, sendo salientable o seu papel como coordinador central das distintas rutas de sinalización celular, esenciais para o correcto funcionamento e homeostase dos organismos. As ciliopatías caracterízanse por unha grande heteroxeneidade xenética e polo seu solapamento xenético e fenotípico, o cal intrica enormemente unha diagnose diferencial e temperá dos pacientes. Dentro deste grupo de enfermidades, a BBS e a ALMS constitúen modelos para o estudo de moitos procesos e enfermidades comúns. A BBS está causada por mutacións nos xenes BBS, téndose descrito na actualidade 21 xenes implicados, mentres que a ALMS é unha síndrome monoxénica orixinada por mutacións no xene ALMS1; ámbalas síndromes presentan un alto grao de solapamento fenotípico. O obxectivo xeral deste proxecto de tese é afondar ... [+]
A síndrome de Bardet-Biedl (BBS) e a síndrome de Alström (ALMS) pertencen ó grupo das ciliopatías, enfermidades producidas por anomalías estruturais e/ou funcionais do cilio primario, un orgánulo de localización ubicua nas células eucariotas. O cilio primario considérase a antena sensorial das células, sendo salientable o seu papel como coordinador central das distintas rutas de sinalización celular, esenciais para o correcto funcionamento e homeostase dos organismos. As ciliopatías caracterízanse por unha grande heteroxeneidade xenética e polo seu solapamento xenético e fenotípico, o cal intrica enormemente unha diagnose diferencial e temperá dos pacientes. Dentro deste grupo de enfermidades, a BBS e a ALMS constitúen modelos para o estudo de moitos procesos e enfermidades comúns. A BBS está causada por mutacións nos xenes BBS, téndose descrito na actualidade 21 xenes implicados, mentres que a ALMS é unha síndrome monoxénica orixinada por mutacións no xene ALMS1; ámbalas síndromes presentan un alto grao de solapamento fenotípico. O obxectivo xeral deste proxecto de tese é afondar nas bases moleculares da BBS e a ALMS, explorando novos mecanismos que poidan estar implicados no seu desenvolvemento para dar resposta á gran variabilidade clínica característica destas dúas ciliopatías. O proxecto dividiráse en dúas fases principais: unha primeira etapa na que se estudará a carga mutacional dalgúns xenes causais e se caracterizarán as variantes atopadas a nivel bioinformático e funcional, e unha segunda fase na que se investigarán potenciais mecanismos non estudados ata o de agora no que concirne ás dúas síndromes, os cales poidan vincularse ó seu desenvolvemento: Así, avaliaráse a carga mutacional dos xenes do complexo CCT/BBS-chaperonina (BBS6-BBS10-BBS12) en pacientes BBS cun resultado negativo para un cribado mutacional previo. Todas as variantes identificadas analizaránse con distintas ferramentas bioinformáticas para predicir a súa patoxenicidade potencial. A continuación, seleccionaránse algunhas variantes, nestes ou noutros xenes, para realizar estudos de minigene assay e determinar se alteran o procesamento do ARN mensaxeiro a través da simulación in vitro do mecanismo de splicing. Ademáis, intentaráse obter toda a información clínica dispoñible daqueles pacientes con mutacións en BBS6-BBS10-BBS12 para establecer unha correlación xenotipo-fenotipo que axude a orientar a diagnose molecular da BBS. Con respecto ó estudo de novos mecanismos, realizaránse dúas aproximacións. En primeiro lugar, analizaráse a susceptibilidade de inactivación de promotores derivada da presenza de metilación, xa que constitúe a modificación epixenética máis amplamente estudada e adoita estar asociada a un silenciamento da expresión xénica. Para iso, avaliaráse in silico a presenza de illas CpG nas rexións promotoras dos xenes BBS e ALMS1, así como de secuencias X-box (implicadas na regulación transcricional de xenes ciliares) e factores de transcrición nestas illas. A continuación, deseñaráse un procedemento experimental mediante PCR cuantitativa específica de metilación para cuantificar o grao de metilación destes promotores, utilizando controles celulares e mostras de pacientes. Finalmente, propónse tamén o estudo da posible relación entre o xene ALMS1 e a ruta de sinalización TGF-β/BMP, coordinada polo cilio primario e clave no control de procesos de proliferación e diferenciación, empregando para iso modelos celulares silenciados para este xene mediante ARN de interferencia, e distintas técnicas experimentais como PCR cuantitativa en tempo real, inmunofluorescencia e western blot. Segundo os resultados obtidos, poderáse estender este estudo a xenes BBS de interese. [-]

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