Comparative ecophysiology of two mixotrophic species of

Abstract

Dinophysis HAB (Harmful Algae Blooms) produce diarrheogenic toxins (okadaic acid and dinophysis toxins) and pectenotoxins (DSP) resulting in long bans in bivalve culture areas in the European Atlantic coast. The species D. acuminata and D. acuta present different distribution patterns, toxin profiles and cause specific impacts on the resources, being an endemic problem in the Galician Rias with closure seasons between 3 and 9 months. Dinophysis presents the difficulty of its cultivation in laboratory for its mixotropic character. The discovery in 2006 of the trophic chain Teleaulax (cryptophyte) -Mesodinium (ciliate) -Dinophysis (dinoflagellate) was used to obtain cultures of Dinophysis in laboratory for the first time. Despite the similarity between D.acuminata and D.acuta, the spatial and temporal gap in their distribution and development of populations of these species suggests that they may be benefiting from an environmental factor other than ingestion of prey. Main objective: comparative ecophysiology of Dinophysis acuminata and Dinophysis acuta: experimental contribution (mixotrophic cultures) to the description of the niche of each species. - Secondary objectives: 1) Identification of the main source of nitrogen: new production (nitrate) and / or regenerated production (ammonium, urea) versus organic matter from the dam (ciliated Mesodinium) to evaluate the contribution in its growth of the nutrients absorbed from the outside versus input of nutrients obtained by ingesting its only known prey, the ciliate Mesodinium. 2) Photosynthetic characterization (P / I curves), toxinological and study of the pigmentary composition in conditions of satiety and fasting of its ciliated prey to understand the physical / biological factors by which the maximum cell of D. acuminata is located in the layer superficial and D. acuta in the pycnocline when they temporarily overlap. 3) Biochemical characterization through the comparison of metabolomic profiles (Ifremer, Nantes). 4) Response to different conditions of small-scale turbulence (SZN, Naples). Methodology: - Nitrogen sources identfication: incubations of D. acuminata and D. acuta cultures, with the addition of nitrogen compounds marked radioactively as substrate: 15NO3- (Na15NO3), 15NH4 + ((15NH4) 2SO4), (15NH2) 2CO.Analysis by mass spectrometry (UAM, Madrid). - Photosynthetic characterization: cultures of the trophic chain species were exposed to different light intensities (0-650 μmol photons m-2s-1) and qualities (white, green and blue) using different grown mediums. • Pigment composition: HPLC analysis with ICM-CSIC experts in Vigo. • PAM Fluorometry: P / I curves and photosynthetic parameters. • Toxins: analysis of methanolic extracts of Dinophysis samples acclimated to different light intensities in the CIMA (Vilaxoán, Xunta de Galicia), using a mass spectrometer for UHPLC analysis. - Biochemical characterization through the comparison of metabolomic profiles: • Biology: Curves and estimation of growth rates. • Phylogenetics: sequencing of the Danish strain of M. rubrum. • Toxins: analysis of hydrolyzed samples (acid hydrolysis) to explore the presence of diol-esters in D. acuta and D. acuminata (directed analyzes).

Measurement systems: • SistemA: HRMS (QTOF 6550) / SistemB: LRMS / MS (API 4000 QTrap) • Metabolomics (non-targeted analysis: MassHunter Workstation Qualitative Analysis software.

- Response to different conditions of small-scale turbulence: Use of the TURBOGEN device capable of producing levels of microscale turbulence similar to those recorded in the natural environment, in computer-controlled mesocosms, with a homogeneous light distribution. Three experiments were performed with 3 levels of turbulence (ɛ): high, medium and low (10-3,10-5 and 10-6 m2 s-3, respectively).

Las FAN (Floraciones Algales Nocivas) de Dinophysis producen toxinas diarreogénicos (ácido ocadaico y dinofisistoxinas) y pectenotoxinas(DSP, Diarrhetic Shellfish Poisoning) y acarrean prolongadas vedas de extracción en zonas de cultivo de bivalvos en la costa Atántica europea. Las especies D. acuminata y D. acuta presentan distintos patrones de distribución, perfiles de toxinas y causan impactos específicos en los recursos,siendo un problema endémico en las Rías gallegas con vedas entre 3 y 9 meses.Dinophysis presenta la dificultad de su cultivo en laboratorio por su carácter mixótrofo. El descubrimiento en el 2006 de la cadena trófica Teleaulax(criptofita)-Mesodinium(ciliado)-Dinophysis(dinoflagelado) fue utilizado para conseguir cultivos de Dinophysis en laboratorio por primera vez. A pesar de la similitud entre D.acuminata y D.acuta, el desfase espacial y temporal en la distribución y desarrollo de poblaciones de estas especies hace pensar que se puedan estar beneficiando de algún factor ambiental distinto a la ingestión de presas. Objetivo principal: ecofisiología comparada de Dinophysis acuminata y Dinophysis acuta: contribución experimental (cultivos mixótrofos) a la descripción del nicho de cada especie. - Objetivos secundarios: 1)Identificación de la fuente principal de nitrógeno: producción nueva (nitrato) y/o producción regenerada (amonio, urea) versus materia orgánica de la presa (ciliado Mesodinium) para evaluar la contribución en su crecimiento de los nutrientes absorbidos del exterior versus aporte de nutrientes obtenidos al ingerir su única presa conocida,el ciliado Mesodinium. 2)Caracterización fotosintética (curvas P/I), toxinológica y estudio de la composición pigmentaria en condiciones de saciedad y ayuno de su presa ciliada para comprender los factores físicos/biológicos por los que el máximo celular de D. acuminata se localiza en la capa superficial y D. acuta en la picnoclina cuando se solapan temporalmente. 3) Caracterización bioquímica a través da la comparación de perfiles metabolómicos (Ifremer, Nantes). 4)Respuesta a distintas condiciones de turbulencia a pequeña escala (SZN, Nápoles). Metodología: - Identificar las fuentes de nitrógeno: incubaciones de cultivos de D. acuminata y D. acuta, con adición de compuestos nitrogenados marcados radioactivamente como sustrato: 15NO3–(Na15NO3), 15NH4+ ((15NH4)2SO4), (15NH2)2CO.Análisis mediante espectrometría de masas (UAM,Madrid). -Caracterización fotosintética: cultivos de las especies de la cadena tróficos fueron expuestos a distintas intensidades de luz (0-650 μmol photons m-2s-1) y calidades (blanca, verde y azul) utilizando distintos medios. • Composición de pigmentos: análisis por HPLC con expertos del ICM-CSIC en Vigo. • Fluorometría PAM: Curvas P/I y parámetros fotosintéticos. • Toxinas: análisis de extractos metanólicos de muestras de Dinophysis aclimatadas a distintas intensidades de luz enel CIMA (Vilaxoán, Xunta de Galicia), utilizando un espectrómetro de masas para el análisis por UHPLC. - Caracterización bioquímica a través de la comparación de perfiles metabolómicos: • Biología: Curvas y estimación de tasas de crecimiento. • Filogenética: secuenciación de la cepa danesa de M. rubrum. • Toxinas: análisis de muestras hidrolizadas (hidrólisis ácida) para explorar la presencia de diol-esters en D. acuta y D. acuminata (análisis dirigidas).

Sistemas de medida: • Sistema A: HRMS (QTOF 6550)/Sistema B: LRMS/MS (API 4000 QTrap) • Metabolómica (análisiss no-dirigidas: software MassHunter Workstation Qualitative Analysis.

- Respuesta a distintas condicións de turbulencia de pequena escala:Uso del dispositivo TURBOGEN capaz de producir niveles de turbulencia de microescala similares a los registrados en el medio natural, en mesocosmos controlados informáticamente, distribuyendo la iluminación de forma homogénea. Se realizaron 3experimentos con 3niveles de turbulencia (ɛ): alta, media y baja (10-3,10-5 y 10-6 m2 s-3,respectivamente).

As FAN (Floracións Algais Nocivas) de Dinophysis producen toxinas diarreoxénicass (ácido ocadaico e dinofisistoxinas) e pectenotoxinas(DSP, Diarrhetic Shellfish Poisoning) e acarrexan prolongadas vedas de extracción en zonas de cultivo de bivalvos na costa Atántica europea. As especies D. acuminata e D. acuta presentan distintos patróns de distribución, perfiles de toxinas e causan impactos específicos nos recursos,sendo un problema endémico nas Rías galegas con vedas entre 3 e 9 meses.Dinophysis presenta a dificultade do seu cultivo en laboratorio polo seu carácter mixótrofo. O descubrimento no 2006 da cadea trófica Teleaulax(criptofita)-Mesodinium(ciliado)-Dinophysis(dinoflaxelado) foi utilizado para conseguir cultivos de Dinophysis no laboratorio por primeira vez. A pesar da similitude entre D.acuminata y D.acuta, o desfase espacial e temporal na distribución e desarrolo de poblacións de estas especies fai pensar que se poidan estar beneficiando de algún factor ambiental distinto á inxestión de presas. Obxectivo principal: ecofisioloxía comparada de Dinophysis acuminata e Dinophysis acuta: contribución experimental (cultivos mixótrofos) á descripción do nicho de cada especie. - Obxectivos secundarios: 1)Identificación da fuente principal de nitróxeno: producción nova (nitrato) e/ou producción rexenerada (amonio, urea) versus materia orgánica da presa (ciliado Mesodinium) para evaluar a contribución ó seu crecemento dos nutrientes absorbidos do exterior versus aporte de nutrientes obtidos ó inxerir a sua única presa coñecida, o ciliado Mesodinium. 2)Caracterización fotosintética (curvas P/I), toxinolóxica e estudo da composición pigmentaria en condicións de saciedade e xaxún da súa presa ciliada para comprender os factores físicos/biolóxicos polos que o máximo celular de D. acuminata se localiza na capa superficial e D. acuta na picnoclina cando se solapan temporalmente. 3) Caracterización bioquímica a través da comparación de perfiles metabolómicos (Ifremer, Nantes). 4)Resposta a distintas condicións de turbulencia a pequena escala (SZN, Nápoles). Metodoloxía: - Identificar as fontes de nitróxeno: incubacións de cultivos de D. acuminata e D. acuta, con adición de compostos nitroxenados marcados radioactivamente como sustrato: 15NO3–(Na15NO3), 15NH4+ ((15NH4)2SO4), (15NH2)2CO.Análisis mediante espectrometría de masas (UAM,Madrid). -Caracterización fotosintética: cultivos das especies da cadea tróficos foron expostos a distintas intensidades de luz(0-650 μmol photons m-2s-1) e calidades (blanca, verde y azul) utilizando distintos medios de crecemento. • Composición de pigmentos: análisis por HPLC con expertos do ICM-CSIC en Vigo. • Fluorometría PAM: Curvas P/I e parámetros fotosintéticos. • Toxinas: análise de extractos metanólicos de mostras de Dinophysis aclimatadas a distintas intensidades de luz no CIMA (Vilaxoán, Xunta de Galicia), utilizando un espectrómetro de masas para o análisis por UHPLC. - Caracterización bioquímica a través da comparación de perfiles metabolómicos: • Bioloxía: Curvas e estimación de tasas de crecemento. • Filoxenética: secuenciación da cepa danesa de M. rubrum. • Toxinas: análise de mostras hidrolizadas (hidrólisis ácida) para explorar a presencia de diol-esters en D. acuta e D. acuminata (análises dirixidas).

Sistemas de medida: • Sistema A: HRMS (QTOF 6550)/Sistema B: LRMS/MS (API 4000 QTrap) • Metabolómica (análisis non-dirixidas: software MassHunter Workstation Qualitative Analysis.

- Resposta a distintas condicións de turbulencia a pequena escala:Uso do dispositivo TURBOGEN capaz de producir niveis de turbulencia de microescala similares ós rexistrados no medio natural, en mesocosmos controlados informáticamente, distribuindo a iluminación de forma homoxénea. Realizáronse 3 experimentos con 3 niveis de turbulencia (ɛ): alta, media e baixa (10-3,10-5e10-6 m2 s-3,respectivamente).