DNA biosensor based on optical detection for environmental control

Abstract

Research objectives

The main goal of the project is to develop a miniaturized optical device for the detection of DNA for multiple applications: early detection of Zebra Mussels (ZM) in river basins and detection of contaminated food by pathogens. The optical device based on DNA detection should be easy to operate, low-cost and allow portability. This project rely on the colorimetry features of gold combined with the sensing ability of recognition elements. The specific objectives of the project include: 1) Synthesis and tuning of nanomaterials The intensity and peak location of the absorption and scattering spectra are highly dependent on the metal nanoparticles (NP) geometry, material, size, inter-particle distance and surrounding media. In this project, two strategies for DNA detection might be used; based on localized surface plasmon resonance coupling for naked-eye detection and/or based on refractive index change provided by DNA or other biomolecules. Gold nanoparticles will be synthesized accordingly to the desired maximum plasmon peak position. 2) Characterization of the nanomaterials Characterization of metal NP should be performed by transmission electron microscopy (TEM), scanning electron microscopy (SEM), dynamic light scattering (DLS) and UV-vis Spectroscopy. 3) Identification of specific targets and probes Identification of target/probe DNA sequences compatible with conventional (PCR) and alternative (enzymatic) amplification methods. The specificity of the selected probes and targets will then be experimentally tested in optimal working conditions and if necessary new sequences will be re-design in an iterative process until reaching the best analytical response. Databases classically used in molecular biology (GeneBank, European Nucleotide Archive (ENA)-EMBL, etc.) will be used to identify a specific sequence for the target and complementary probes. Target and complementary DNA sequences will also be analysed using Geneious software. 4) Chemical functionalization of NP with DNA recognition element DNA sequences will be modified with suitable chemical groups and oligonucleotides to allow their chemical immobilization on the nanoparticles surface. The optimization of DNA surface coverage, spacer effect and salt conditions to prevent aggregation are crucial to achieve the best hybridization efficiency. 5) Evaluation of NP-based detection approach The evaluation of the NP-based detection approach will involves the assessment of the optical response, the evaluation of the specificity of the selected DNA sequences, analysis and comparison of both strategies for target recognition and testing of the selected detection strategies with real and spiked samples. Spiked and real samples which undergo amplification will be used to study matrix effects on the analytical response of the biosensor. Interference tests will also be performed, using chemical compounds or DNA from other microorganisms by competitive assays. 6) Integration of the optical detection approach on a miniaturized device The best approach for the recognition of the target DNA is selected for the development of a miniaturized devices for in situ detection and the device is then used to evaluate the following analytical responses: 6.1. Integration of the optical sensor with a microfluidic device The best optical sensor to record quantification of specific DNA targets is then integrated on a microfluidic device that allows the use of small volumes and rapid analysis of the target solutions. 6.2. Evaluation of naked eye detection on multichannel microfluidic devices The development of a multi task device could be achieved by integrating the device with other analytical devices previously developed as modules (DNA purification or amplification) towards a Micrototal Analysis System (µTAS). The technical studies such as SEM, TEM, DLS, Atomic Force Microscopy (AFM), Spectroscopy Fluorescence and Micro spotter will be a part of the PhD project.

Objetivo principal Desarrollo de un dispositivo óptico miniaturizado para la detección de ADN para: detección temprana de mejillón cebra (ZM) en las cuencas hidrográficas y detección de alimentos contaminados por agentes patógenos. El dispositivo óptico basado en la detección de ADN debe ser fácil de operar y de bajo coste. Se utilizará la colorimetría característica del oro combinado con la capacidad de detección de elementos de reconocimiento. Objetivos específicos 1) Síntesis de nanomateriales y optimización La intensidad y la localización del pico de los espectros de absorción y dispersión son altamente dependientes de la geometría de las nanopartículas metálicas (NP), el material, el tamaño, la distancia entre las partículas y el medio circundante. En este proyecto, se utilizarán dos estrategias para la detección de ADN; el acoplamiento de resonancia del plasmón superficial localizado para la detección visual y/o el basado en el cambio en el índice de refracción proporcionado por el ADN. Las nanopartículas de oro se sintetizarán teniendo en cuenta la posición de extinción máxima de la banda plasmónica deseada. 2) Caracterización de los nanomateriales La caracterización de las nanopartículas metálicas debe ser realizada por microscopía electrónica de transmisión (TEM), microscopía electrónica de barrido (SEM), dispersión de luz dinámica (DLS) y espectroscopia UV-vis. 3) identificación de secuencias diana y sondas La especificidad de las secuencias seleccionadas será evaluada experimentalmente en condiciones óptimas de trabajo y, si es necesario, se rediseñarán nuevas secuencias en un proceso iterativo hasta alcanzar la mejor respuesta analítica. Se utilizarán bases de datos típicas (GeneBank, European Nucleotide Archive (ENA)-EMBL, etc.) para identificar la secuencia diana específica y las sondas complementarias. Estas secuencias también serán analizadas utilizando el software Geneious. 4) Funcionalización química de NPs con elemento de reconocimiento (ADN) Las secuencias de ADN serán modificadas con grupos adecuados para permitir su inmovilización química en la superficie de las nanopartículas. La optimización de la cobertura de superficie, el efecto de secuencias de ADN espaciadoras, y las condiciones de sal para prevenir la agregación, son cruciales para lograr la mejor eficiencia de hibridación. 5) Evaluación de la detección basada en el uso de NPs La evaluación de la detección basada en NPs incluye la evaluación de la respuesta óptica, la evaluación de la especificidad de las secuencias de ADN seleccionadas, el análisis y la comparación de ambas estrategias para el reconocimiento de la secuencia diana y la evaluación de las estrategias de detección seleccionadas con muestras reales y muestras enriquecidas. Se realizará un estudio de los efectos de matriz en la respuesta analítica del biosensor. Se realizarán pruebas de interferencia, utilizando compuestos químicos o ADN de otros organismos mediante ensayos competitivos. 6) Integración de la estrategia de detección óptica en un dispositivo miniaturizado Se seleccionará la mejor estrategia para el reconocimiento del ADN diana para el desarrollo de un dispositivo miniaturizado para la detección in situ, este dispositivo será utilizado para evaluar las siguientes respuestas analíticas: 6.1. Integración del sensor óptico con un dispositivo microfluídico Se integrará un sensor óptico en un dispositivo microfluidico para la cuantificación de dianas de ADN específicas que permitirá el uso de pequeños volúmenes y el análisis rápido de la soluciones a analizar. 6.2. Evaluación de la detección colorimétrica en dispositivos microfluidicos multicanal El desarrollo de un dispositivo multi-función podría lograrse integrando el dispositivo con otros dispositivos analíticos desarrollados anteriormente como módulos (la purificación del ADN o amplificación) hacia un micro-sistema de análisis total (µTAS).

Obxectivo Principal Desenvolver un dispositivo óptico miniaturizado para a detección de ADN para: detección precoz de mexillóns cebra (MZ) en cuencas hidrográficas e detección de alimentos contaminados por patóxenos. O dispositivo óptico baseado na detección de ADN debe ser doado de manexar e de baixo custo. Este proxecto está baseado na colorimetría característica do ouro combinada coa capacidade de detectar elementos de recoñecemento. Obxectivos específicos 1) A síntese de nanomateriais e optimización A intensidade e localización do pico dos espectros de absorción e dispersión dependen moito da xeometría das nanopartículas metálicas (NP), o material, o tamaño, a distancia entre as partículas eo medio circundante. Neste proxecto, utilizaranse dúas estratexias para a detección de ADN; o acoplamento de resonancia do plasmón de superficie localizado para a detección visual e / ou o baseado no cambio no índice de refracción proporcionado polo ADN. As nanopartículas de ouro sintetizaranse tendo en conta a posición de máxima extinción da banda plasmónica desexada. 2) Caracterización dos nanomateriais A caracterización das nanopartículas metálicas debe realizarse mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM), microscopía electrónica de barrido (SEM), espectroscopia de luz dinámica (DLS) e UV-vis. 3) Identificación de secuencias diana e sondas A especificidade das sondas seleccionadas e as secuencias diana serán avaliadas experimentalmente en condicións de traballo óptimas e, de ser necesario, as novas secuencias serán rediseñadas nun proceso iterativo ata conseguir a mellor resposta analítica. As bases de datos típicas (GeneBank, European Nucleotide Archive (ENA) -EMBL, etc.) usaranse para identificar a secuencia diana específica e as sondas complementarias. As secuencias diana e as secuencias de ADN complementarias tamén se analizarán mediante o software Geneious. 4) Funcionalización química de NPs con elemento de recoñecemento (ADN) As secuencias de ADN serán modificadas con grupos axeitados para permitir a súa inmovilización química na superficie das nanopartículas. A optimización da cobertura superficial, o efecto das secuencias de ADN espaciais e as condicións de sal para evitar a agregación son cruciales para lograr a mellor eficiencia de hibridación. 5) Avaliación de detección baseada no uso de NPs A avaliación da detección baseada en NPs inclúe a avaliación da resposta óptica, a avaliación da especificidade das secuencias de ADN seleccionadas, a análise e a comparación de ambas as estratexias para o recoñecemento da secuencia diana e a avaliación das estratexias de detección seleccionada con mostras reais e mostras enriquecidas. Tanto as mostras amplificadas reais como enriquecidas serán utilizadas para o estudo dos efectos da matriz na resposta analítica do biosensor. As probas de interferencia realizaranse utilizando compostos químicos ou ADN doutros organismos a través de ensaios competitivos. 6) Integración da estratexia de detección óptica nun dispositivo miniaturizado A mellor estratexia para o recoñecemento do ADN diana será seleccionada para o desenvolvemento dun dispositivo miniaturizado para a detección in situ, e este dispositivo empregarase para avaliar as seguintes respostas analíticas 6.1.) Integración do sensor óptico cun dispositivo microfluídico O sensor óptico que nos permite cuantificar ADN diana específicos integrarase nun dispositivo microfluídico que permitirá o uso de pequenos volumes e unha rápida análise das solucións a analizar. 6.2.) Avaliación da detección colorimétrica en dispositivos microfluídicos multicanal O desenvolvemento dun dispositivo multi-función podería lograrse integrando o dispositivo con outros dispositivos analíticos desenvolvidos previamente como módulos (purificación ou amplificación de ADN) nun micro-sistema de análise total (μTAS).