Desarrollo de biomarcadores de metilación no invasivos para el cribado de cáncer colorrectal

Abstract

El objetivo de este proyecto de tesis es identificar, utilizando tecnología de arrays, biomarcadores de metilación en suero para la detección de tumores colorrectales y adenomas avanzados, que puedan utilizarse en programas de cribado. Para la primera etapa del proyecto (microarrays de metilación), se emplearán muestras de suero de individuos que han sido sometidos a una colonoscopia; para la segunda etapa del estudio (test y validation) se incluirán individuos asintomáticos provenientes de una cohorte independiente de cribado de riesgo medio a los que se les realizó una colonoscopia y el test de sangre oculta en heces (TSOHi). El ADN libre se extraerá a partir de las muestras de suero y, posteriormente, será modificado con bisulfito de sodio (ADNb). Los microarrays de metilación comerciales se hibridarán con pooles de ADNb para determinar el patrón de metilación de los distintos grupos: sin hallazgos, patologías benignas, adenomas no avanzados, adenomas avanzados (AA) y CCR. Comparando los patrones de metilación obtenidos, se seleccionarán marcadores candidatos que discriminen los casos de neoplasia avanzada (AA y CCR) del resto de individuos. La utilidad de estos candidatos se verificará mediante PCR cuantitativa específica de metilación (qPCR-MS) en un grupo reducido de individuos procedentes de la cohorte de riesgo medio (test set). Los marcadores con mejor eficiencia diagnóstica para detectar neoplasia avanzada se validarán en el resto de la cohorte de riesgo medio (validation set) y en nuevos casos de CCR y AA reclutados durante el estudio. Finalmente, se construirán modelos de regresión logística multivariante para determinar la combinación óptima de marcadores séricos de metilación para la detección de CCR y AA. La capacidad diagnóstica del panel de metilación propuesto sería comparada con la que presenta el TSOHi.

O obxectivo deste proxecto de tese é identificar, utilizando tecnoloxía de arrays, biomarcadores de metilación en soro para a detección de tumores colorrectais e adenomas avanzados que poidan utilizarse en programas de cribado. Para a primeira etapa do proxecto (microarrays de metilación) empregaranse mostras de soro de individuos que foron sometidos a unha colonoscopia; para a segunda etapa do estudo (test e validation) incluiranse individuos asintomáticos provenientes dunha cohorte independente de cribado de risco medio aos que se lles realizou unha colonoscopia e o test de sangue oculto en feces inmunolóxico (TSOHi). O ADN libre extraerase a partir das mostras de soro e posteriormente será modificado con bisulfito de sodio (ADNb). Os microarrays de metilación comerciais se hibridarán con pooles de ADNb para determinar o patrón de metilación dos distintos grupos: sen achados, patoloxías benignas, adenomas non avanzados, adenomas avanzados (AA) e CCR. Comparando os patróns de metilación obtidos seleccionaranse marcadores candidatos que discriminen os casos de neoplasia avanzada (AA e CCR) do resto de individuos. A utilidade destes candidatos verificarase mediante PCR cuantitativa específica de metilación (qPCR-MS) nun grupo reducido de individuos procedentes da cohorte de riso medio (test set). Os marcadores con mellor eficiencia diagnóstica para detectar neoplasia avanzada validaranse no resto da cohorte de risco medio (validation set) e en novos casos de CCR e AA recrutados durante o estudo. Finalmente construiranse modelos de regresión loxística multivariante para determinar a combinación óptima de marcadores séricos de metilación para a detección de CCR e AA. A capacidade diagnóstica do panel de metilación proposto sería comparada coa que presenta en TSOHi.

The aim of this project is to identify, based on array technology, serum methylation markers for the detection of colorectal cancer tumors and advanced adenomas to be used in screening programs. For the first stage of the project (methylation microarrays) serum samples from individuals who have undergone a colonoscopy will be used; for the second stage of the study (test and validation), we will include asymptomatic individuals from an independent cohort of medium risk screening who underwent a colonoscopy and a fecal immunological test (FIT). Free DNA will be extracted from serum samples from all patients and this DNA will be further treated with sodium bisulphite (bDNA). Using commercial available methylation microarrays hybridized with pools of bDNA, the methylation pattern of different groups will be analysed (no colorectal findings, benign pathologies, non-advanced adenomas, advanced adenomas (AA) and CRC). The comparison of methylation patterns will allow the selection of candidate markers able to distinguish advanced neoplasia cases (AA and CRC) from the rest. The utility of these candidates will be verified using methylation-specific qPCR (qPCR-MS) in a group of individuals belonging to the medium risk cohort (test set). The markers that show the best diagnostic efficiencies to detect advanced neoplasia will be validated in the rest of the medium risk cohort (validation set) that will also include new CRC and AA cases enrolled during the project. Based on logistic regression multivariate analysis, an optimal combination of serum methylation markers will be proposed for the detection of CRC and AA. At last, the diagnostic capability of the methylation panel will be compared with that of FIT.