Ecology of loliginid squid in a coastal upwelling

Abstract

The main aim of this work was to learn more about the paralarval phase of loliginid squids, probably the most difficult phase to study, which are of high interest for stock predictions, growth models or as a model for ontogenetic patterns. Two main difficulties are constraining this field, namely the scarcity of squid paralarvae in the plankton and the lack of reliable morphological characters to accurately identify the paralarvae. Previous studies showed an unexpected diversity of loliginid paralarvae in the plankton of NW Iberian Peninsula, traditionally considered to be exclusively inhabited by Loligo vulgaris. Accordingly, the hidden diversity of loliginid paralarvae was unraveled to establish baseline studies for future species-specific management strategies. Visual identification of early life stages in squids can be problematic because ethanol-preserved paralarvae might lose the chromatophore patterns that help to identify each species. Therefore, molecular approaches are the only reliable tools to identify different species, when morphological characters are lost or not yet developed. For this study, the mitochondrial cytochrome c oxidase subunit 1 (COI), also known as the barcoding gene, was used to unequivocally identify the different loliginid paralarvae. In Galician waters, three different species were identified: Loligo vulgaris (n=99), Alloteuthis media (n=118) and Alloteuthis subulata (n=15) showing a different spatial distribution pattern. While in the south-west of Galicia the most abundant species was A. media, in the north is A. subulata. Loligo vulgaris maintained its abundance similar in both locations. These differences between Alloteuthis species, might result from interspecific competitive interactions, in order to minimize resource competition by shifting the habitat, both horizontally and vertically. Understanding the demographic structure of these three loliginid species along the Galician coast, involves estimating growth patterns for each species. Consequently, statoliths were extracted and growth increments were counted. Statistical analyses showed significant differences on dorsal mantle length (DML) at age between gender, being L. vulgaris larger at the same age than A. media and A. subulata. Additionally, instantaneous relative growth rates were higher in spring than in autumn for all species. The paralarvae of L. vulgaris and A. media reflected two well differentiated hatching peaks, one in late spring-early summer and another peak in late autumn. Meanwhile, the hatching peak for A. subulata occurred in spring, before than the other two loliginids, and a second peak that was almost negligible owed to the lack of paralarvae. The following step was focused on L. vulgaris due to its high market value and importance for local fisheries along the Western Iberian Peninsula waters (WIP). The next biological question was to elucidate the diet of L. vulgaris paralarvae in the wild applying next generation sequencing (NGS). The digestive system of 31 paralarvae was dissected and a 300bp section of COI gene was sequenced with the MiSeq platform. In total, 45 taxa were identified belonging to 34 species: 20 species of crustaceans, 3 of fish, 4 of Cnidaria, 2 of Echinodermata and 5 of molluscs including cephalopods. This trophic study revealed that the European common squid, L. vulgaris, is a generalist predator during their paralarval phase. Finally, the genetic diversity and population connectivity of L. vulgaris was studied in detail along the WIP. Two molecular approaches were used for this study: 1) COI data and double digest restriction-site associated DNA sequencing (ddRADseq). The results obtained revealed 79 haplotypes out of 160 COI sequences, while the SNP data set included 86,431 loci after filtering for 38 individuals with 86,319 neutral loci. Both techniques showed high genetic diversity and homogeneity with high gene flow, revealing a single population along the WIP, which can be managed as a single unit.

El principal objetivo de este trabajo fue mejorar el conocimiento de la ecología de los loligínidos, centrando los estudios en la etapa planctónica que es la más desconocida y esencial para evaluación de stocks, desarrollar modelos de crecimiento o estudiar desarrollo ontogenético, entre otros. Sin embargo, el estudio de la etapa larvaria de cefalópodos es muy complejo debido a la escasez de paralarvas y a la falta de caracteres morfológicos que permitan identificarlas inequívocamente. Estudios previos mostraron que, en el Noroeste de la Península Ibérica, Loligo vulgaris no era el único loligínido presente en el plancton, sino que cohabitan con paralarvas de su misma familia. Por lo tanto, el primer objetivo consistía en desentrañar cuales son estas especies, para poder estudiarlas por separado y establecer las bases para desarrollar futuras herramientas de gestión. La identificación visual de los calamares en sus primeras etapas de vida puede ser bastante difícil debido a que las paralarvas que se conservan en etanol tienden a perder los patrones de cromatóforos que caracterizan a cada especie. Por lo tanto, las técnicas moleculares son las únicas herramientas seguras para identificar las diferentes especies que habitan en un área. Para este fin, se empleó uno de los genes mitocondriales más frecuentes en genómica, que es la subunidad 1 del citocromo c oxidasa (COI). En la costa gallega, se identificaron genéticamente tres especies: Loligo vulgaris (n=99), Alloteuthis media (n=118) y Alloteuthis subulata (n=15) mostrando diferencias en su distribución espacial. Mientras que la especie más abundante en el suroeste de Galicia fue A. media, en el norte de Galicia fue A. subulata. L. vulgaris mantuvo una frecuencia similar en las dos localizaciones muestreadas. Estas diferencias entre ambas especies de Alloteuthis, pueden ser debidas a competencia interespecífica y una manera de evitarla es ocupar distintos nichos dentro del mismo hábitat. Para entender la estructura demográfica de las tres especies de loligínidos en la costa gallega, el siguiente paso fue calcular los patrones de crecimiento de cada especie. Los estatolitos de cada especie se extrajeron y los anillos de crecimiento fueron contados. Los resultados estadísticos mostraron que existen diferencias de tamaño con la misma edad entre los diferentes géneros, siendo L. vulgaris más grande que A. media y A. subulata. Por otro lado, los cálculos de la tasa de crecimiento relativo instantáneo mostraron valores más altos en verano que en otoño para las tres especies. Las paralarvas de L. vulgaris y de A. media reflejaron dos picos de eclosión bien diferenciados, el primero en primavera/primeros de verano y un segundo pico en el otoño. Por otro lado, el pico de eclosión de A. subulata ocurre en primavera, antes que las otras dos especies de loligínidos y un segundo pico casi imperceptible debido a la escasez de paralarvas muestreadas. El siguiente paso se centró en la ecología de L. vulgaris debido a su alto valor en pesquerías. Uno de los aspectos desconocidos de su ciclo vital es la dieta de las paralarvas en la naturaleza. Para determinar la dieta de las paralarvas salvajes de L. vulgaris capturadas a lo largo de la costa oeste de la Península Ibérica se emplearon técnicas de secuenciación masiva (NGS). Se diseccionó el sistema digestivo de 31 paralarvas y se secuenció una sección de 300 pb del gen COI con la plataforma MiSeq. En total, se identificaron 45 taxones pertenecientes a 34 especies: 20 especies de crustáceos, 3 peces, 4 cnidarios, 2 chinodermos y 5 moluscos, incluyendo cefalópodos. El estudio trófico reveló que el calamar común europeo, L. vulgaris, es un depredador generalista durante su fase planctónica. El objetivo final fue comprender la diversidad genética y la conectividad poblacional de L. vulgaris a lo largo de la costa de la Península Ibérica. Se utilizaron dos enfoques moleculares para este estudio: 1) la amplificación de COI y la aplicación de la secuenciación de ADN asociada al sitio de restricción de doble digestión (ddRADseq). Los resultados obtenidos revelaron 79 haplotipos de 160 secuencias COI, mientras que el conjunto de datos SNP incluía 86.431 loci después de filtrar 38 individuos, de los cuales 86.319 loci fueron neutros. Ambas técnicas mostraron una alta diversidad y homogeneidad genética con un alto flujo de genes a lo largo de la costa oeste de la Península Ibérica, que sugiere la presencia de una única población a efectos de estrategias de gestión pesquera.