Caracterización citogenética de bivalvos veneroideos y algunos de sus parásitos

Abstract

Los bivalvos son un grupo de moluscos exclusivamente acuícolas caracterizados por presentar un cuerpo comprimido lateralmente cuyas partes blandas están recubiertas por una concha (Gosling 2015). Las más de 8500 especies aceptadas en la actualidad según el World Register of Marine Species (WoRMS, http://www.marinespecies.org/) se distribuyen por todo el planeta ocupando ecosistemas tanto marinos como salobres y, en menor medida, de agua dulce. Los bivalvos incluyen un buen número de especies de gran interés económico y juegan un papel ecológico fundamental en ambientes bentónicos. Los bivalvos son, además, hospedadores intermediarios de digeneos parásitos, que pueden llegar a tener un enorme impacto en poblaciones, tanto naturales como de cultivo, de bivalvos. Si bien la clasificación de los bivalvos es un tema bastante controvertido y análisis filogenéticos recientes (Bieler et al. 2014) proponen la existencia de seis linajes monofiléticos en la clase Bivalvia, WoRMS todavía usa cuatro subclases, Protobranchia, Pteriomorphia, Paleoheterodonta, y Heterodonta. La subclase Heterodonta incluye más de dos tercios de los bivalvos actuales y es extremadamente diversa en cuanto a forma, tamaño, anatomía y hábitos de vida y las filogenias moleculares más recientes han constatado que algunos de los órdenes, superfamilias y familias incluidos en ella son grupos para o polifiléticos (Bieler et al. 2014). Debido a ello, su taxonomía está en continua revisión. Un buen ejemplo de esta situación es el tradicional orden Veneroida que en la actualidad ya no se considera ni morfológicamente homogéneo ni monofilético y, por tanto, es cuestionado a pesar de su enorme importancia pues engloba algunas de las familias con mayor número de especies descritas (Veneridae, 680 especies; Mactridae, 180; Donacidae, 100; Tellinidae, 500) (Huber 2010, 2015). La mayoría de los estudios cromosómicos en bivalvos se limitan a la descripción del número cromosómico y el cariotipo organizado en función de la morfología y el tamaño de los pares cromosómicos (Nakamura 1985; Thiriot-Quiévreux 1994). Los análisis de este tipo realizados a lo largo del pasado siglo llevaron a proponer que los números cromosómicos eran relativamente estables dentro de cada familia de bivalvos y que se agrupaban en torno a los 2n = 20 habituales en Ostreidae, los 2n = 28 de Mytilidae y Pteridae y los 2n = 38 de la mayoría de las restantes familias, incluida Veneridae (ThiriotQuiévreux 1994). No obstante, el incremento en el número de especies analizadas ha demostrado que algunas familias y géneros de bivalvos presentan especies con distintos números cromosómicos. Esto no parece ser el caso en la subclase Heterodonta puesto que la inmensa mayoría de las especies analizadas son 2n = 38. Además, los cariotipos de estas especies suelen presentar cromosomas en los que morfología y tamaño muestran escasas diferencias (Nakamura 1985; Thiriot-Quiévreux 1994, 2002). Esta homogeneidad dificulta la identificación de pares cromosómicos concretos y hace que las homologías cromosómicas interespecíficas descritas sean una suposición. Así pues, a fin de comparar los cariotipos de bivalvos en general y de veneroideos en particular, es necesario explorar otras metodologías, entre ellas las técnicas de bandeo cromosómico o la hibridación in situ fluorescente (FISH). En bivalvos se han mapeado mediante FISH genes rRNA 45S en unas 50 especies, genes rRNA 5S en unas 25, genes de las histonas del núcleo en 15, genes de las histonas de unión en seis y secuencias teloméricas en unas 25 (Thiriot-Quiévreux 2002; Leitão y Chaves 2008; Petrović et al. 2009; PérezGarcía et al. 2010a, 2010b, 2011, 2014a, 2014b; Bouilly et al. 2010; Carrilho et al. 2011; Hurtado et al. 2011; González-Tizón et al. 2013; Li et al. 2016; García-Souto et al. 2017). Estas técnicas han posibilitado el establecimiento de cariotipos más fiables y una mejor comprensión de los cambios cromosómicos que han acompañado su evolución (Pérez-García et al. 2014b) pero también han contribuido a entender mejor sus filogenias. Además, la aplicación de estas técnicas en especies de estas familias ha permitido comprobar que frente a la presunta conservación cariotípica que se deducía tras aplicar técnicas citogenéticas clásicas, la situación cromosómica de estas secuencias puede presentar variaciones considerables. Por ejemplo, las especies atlánticas de ostras se diferencia de sus congéneres pacíficas por la posición de los genes rRNA 45S, demostrando que incluso cariotipos aparentemente muy conservados muestran divergencias (Wang et al. 2004). A estos mismos grupos se refiere la mayoría de las localizaciones cromosómicas de DNA satélites en bivalvos (Clabby et al. 1996; Wang et al. 2001; Martínez-Lage et al. 2002; Cross et al. 2005; Odierna et al. 2006; Biscotti et al. 2007; Bouilly et al. 2008; López-Flores et al. 2010; Hu et al. 2011; Petraccioli et al. 2015). En Heterodonta la aplicación de técnicas de mapeo cromosómico es todavía más escasa. Hasta la fecha se han localizado mediante FISH los genes rRNA 45S en 18 especies, los genes rRNA 5S en 9, los genes de las histonas del núcleo en 2 y secuencias teloméricas en 12 (Insua et al 1999; González-Tizón et al. 2000; Wang y Guo 2001, 2007, 2008; Martínez et al. 2002; Plohl et al. 2002; Fernández-Tajes et al. 2003, 2008; Hurtado y Pasantes 2005; Petrović et al. 2009; Bouilly et al. 2010; Carrilho et al. 2011; Hurtado et al. 2011; González-Tizón et al. 2013; Pérez-García et al. 2014a). Casi todas estas especies son 2n = 38 y sus cariotipos relativamente similares pero presentan considerables diferencias en la distribución cromosómica de estas secuencias, demostrando, por tanto, su interés como marcadores para deducir relaciones de parentesco evolutivo. Por lo que se refiere a ADN satélites, las únicas especies de la subclase Heterodonta en las que se han localizado este tipo de secuencias son la almeja fina, Ruditapes philippinarum (Passamonti et al. 1998) y la coquina, Donax trunculus (Petrović et al. 2009). Si los estudios citogenéticos en bivalvos son escasos, todavía lo son mucho más en trematodos digeneos. Pese a ser el grupo mayoritario de metazoos endoparásitos con más de 18000 especies, sólo se han descrito números cromosómicos y cariotipos en unas 300 y se han localizado mediante FISH secuencias teloméricas y/o genes de los rRNA 45S en 9 (Hirai et al. 1989, 2000; Baršiené 1993; Hirai y Lo Verde 1996; Bell et al. 1998; Petkevičiūtė et al. 2003; Špakulová y Casanova 2004; Reblánová et al. 2011; Zadesenets et al. 2012a, 2012b; Petkevičiūtė et al. 2012, 2014, 2015; Hirai 2014; Sofi et al. 2015). Por ello, para incrementar el conocimiento citogenética en especies de Veneroida y de algunos de los trematodos digeneos que las parasitan, analizamos los cromosomas de 20 especies de Veneridae (Ruditapes philippinarum, R. decussatus, Venerupis corrugata, Clausinella fasciata, Chamelea gallina, C. striatula, Venus verrucosa, Venus casina, Dosinia exoleta, Dosinia lupinus and Petricola litophaga), Mactridae (Spisula subtruncata, S. solida and Mactra stultorum), Donacidae (Donax trunculus and D. vittatus) y Tellinidae (Bosemprella incarnata, Macomangulus tenuis, Moerella donacina and Serratina serrata) y de 10 taxones de parásitos digeneos, Bucephalus minimus, B. australis, Prosorhynchoides carvajali (Bucephaloidea), Monascus filiformis (Gymnophalloidea), Parorchis acanthus (Echinostomatoidea), Cryptocotyle lingua (Opisthorchioidea), Cercaria longicaudata, Monorchis parvus (Monorchioidea), Diphterostomum brusinae y Bacciger bacciger (Microphalloidea) aislados a partir de 12 moluscos que actúan como huéspedes intermedios. La aproximación general consistió en aplicar diversas combinaciones de fluorocromos base-específicos (4’-6-diamidino-2-phenylindol DAPI, DNA rico en AT; cromomicina A3, CMA, DNA rico en GC) e inespecíficos (ioduro de propidio, PI), bandas C e inmunodetección de 5-methyl-cytosine además de mapear sondas de DNA repetido (rDNA 45S y 5S, genes de histonas, secuencias telomericas y DNA satélites) sobre sus cromosomas. Se obtuvieron preparaciones cromosómicas utilizando métodos previamente publicados (Méndez et al. 1990; Pasantes et al. 1990). Después de tratar los bivalvos con colchicina, se diseccionaron branquias y gónadas y se sumergieron en agua de mar al 50% y al 25% antes de fijarlas en una mezcla de etanol y ácido acético. Las paralarvas de digeneos fueron tratadas del mismo modo. En ambos casos las muestras ya fijadas fueron desagregadas en una disolución de ácido acético al 60% hasta obtener suspensiones celulares que se dejaron caer gota a gota sobre portaobjetos precalentados a 50 °C. La tinción con fluorocromos se llevó a cabo tal y como describen Pérez-García et al. (2010b). Después de controlar su calidad mediante microscopía de contraste de fases (Nikon), las preparaciones fueron teñidas con CMA (0.25 mg/mL), contrateñidas con DAPI (0.14 g/mL), lavadas en agua corriente, se dejaron secar al aire y se montaron (Vectashield, Vector). Las preparaciones se estudiaron y fotografiaron mediante microscopía de fluorescencia (Nikon Eclipse-800). Se tomaron imágenes separadas para cada fluorocromo con una cámara CCD DS-Qi1Mc (Nikon) controlada con el programa NIS-Elements (Nikon). La superposición de las imágenes se realizó con Adobe Photoshop. Tras ser fotografiadas, las preparaciones se retiñeron con una combinación de DAPI y PI (0.07 g /mL), se lavaron en agua corriente, se dejaron secar al aire, se montaron y se volvieron a fotografiar. La extracción de DNA se realizó mediante cloroformo/isoamilalcohol o con el EZNA Mollusc DNA Kit (OMEGA). En los casos necesarios se amplificaron por PCR fragmentos del gen COI mitocondrial usando los cebdores LCO1490 y HCO2198 (Folmer et al. 1994). Para amplificar un fragmento del gen rRNA 16S mitocondrial se usaron los cebadores 16L29 (Schubart et al. 2001) y 16SBr (Palumbi 1996). El segmento ITS2 del rDNA 45S se amplificó con los cebadores ITS3 e ITS4 (White et al. 1990). Para su uso como sondas FISH, se utilizaron los cebadores universales LR10R y LR12 (Vilgalys lab website, http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm) para amplificar un fragmento del 28S rDNA. Para amplificar el 5S rDNA y el gen de la histona H3 se usaron los cebadores descritos por Pérez-García et al. (2010a, 2010b) y por Giribet y Distel (2003), respectivamente. Las secuencias de DNA se amplificaron (GeneAmp PCR system 9700, Applied Biosystems) en volúmenes de 50 µL que contenían 125 ng de DNA genómico, 50M de cada dNTP, 50 M de cada cebador, 1x tampón de PCR, 15 M de MgCl2 y 5 U de JumpStart™ Taq DNA Polymerase (Sigma). Las amplificaciones incluyeron una desnaturalización inicial a 95 ºC (2 min), 35 ciclos de amplificación y una extensión final a 72 °C (5 min). Las secuencias amplificadas fueron purificadas (FavorPrepTM GEL/PCR Purification Kit, Favorgen) y secuenciadas (CACTI, Universidad de Vigo) en ambos sentidos en un ABI PRISM 3730 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) usando un BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Las secuencias se editaron con BioEdit v. 7.1.11 (Hall 1999) y se alinearon con Muscle usando los parámetros por defecto en MEGA7 (Kumar et al. 2016). Se realizaron búsquedas de secuencias con el algoritmo Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), disponible en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Se empleó el algoritmo MegaBLAST, con parámetros por defecto, para comparar las secuencias con las existentes en las bases de datos del NCBI y del Barcode of Life Data System (BOLD). Los cromosomas se hibridaron con sondas de rDNA 5S y 28S y de genes de la histona H3 (Pérez-García et al. 2011). La sondas 28S rDNA se marcaron con biotina-16-dUTP (Roche Applied Science) o digoxigenina-11-dUTP (10x DIG Labeling Mix, Roche Applied Science) usando un kit de nick translation (Roche Applied Science). Las sondas para el gen de la histona H3 y para el rDNA se marcaron directamente por PCR con biotina-16-dUTP (20 M) o digoxigenina-11-dUTP (5 M). Las preparaciones recibieron tratamientos con RNasa y pepsina, se desnaturalizaron (70 ºC, 2 min) y se hibridaron a 37 ºC. La biotina fue detectada con avidina conjugada con isotiaocianato de fluoresceína (FITC) y anti-avidina biotinilada (Vector). La digoxigenina se detectó con anticuerpos antidigoxigenina conjugados con isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC) (Sigma). Una vez contrateñidas con DAPI, se montaron y se examinaron al microscopio. Se tomaron imágenes para cada fluorocromo por separado, se seudocolorearon y se superpusieron de la manera indicada más arriba. También se realizaron experimentos FISH utilizando una sonda telomérica (C3TA2)3 péptido nucleica (PNA) (Applied Biosystems) siguiendo el protocolo indicado por el suministrador. Se realizaron análisis cromosómicos y cariotipicos sobre un mínimo de 10 ejemplares por especie (5 machos, 5 hembras). Para cada especie, se construyeron cariotipos a partir de un mínimo de 10 metafases completas con señales de FISH y se midieron en ellas las longitudes de los brazos cromosómicos. A partir de estos datos se calcularon longitudes relativas e índices centroméricos. En concordancia con datos previos, todas las especies aquí estudiadas poseen 2n = 38 y sus cariotipos suelen estar formados por cromosomas que muestran una distribución de longitudes cuasi continua. En 16 de las 20 especies las regiones ricas en GC coincidieron con los NORs pero las cuatro restantes, Donax trunculus, D. vittatus, Mactra stultorum y Spisula subtruncata, presentaron bandas intercalares adicionales. Además, se identificó un nuevo DNA satélite como el componente principal de la heterocromatina rica en GC de S. subtruncata. Como predice la library hypothesis, este DNA satélite también fue detectado en M. stultorum y S. solida, mostrando en ellas una gran conservación de la secuencia pero una drástica reducción en el número de copias. Se determinó también el grado de metilación de este satélite mediante secuenciación genómica con bisulfito e inmunodetección de 5-metilcitosina y los resultados se compararon con los detectados mediante polimorfismos de amplificación sensible a la metilación (MSAP) y ensayos por inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA). La metilación del satélite fue alta para lo habitual en bivalvos y triplicó la media de metilación del genoma de S. subtruncata. En relación al mapeo mediante FISH, los patrones de distribución de las agrupaciones de genes de la histona H3, del rDNA 5S y del rDNA 45S en especies de Veneroida presentaron algunas peculiaridades. En la familia Veneridae se identificaron un total de 18 loci para las agrupaciones de genes de histona H3 en las 11 especies analizadas. En seis de las especies apareció una única agrupación mientras que Chamelea striatula presentó cuatro y las cuatro especies restantes dos. Quince de estos loci son subterminales, dos intercalares y el restante subcentromérico. Excepto Chamelea striatula todas estas especies presentaron una única agrupación 45S rDNA. Por el contrario, para el 5S rDNA sólo apareció una única localización en cinco especies, dos en otras cinco especies y tres en la restante, Petricola litophaga. Las señales aparecieron en cromosomas distintos salvo en Clausinella fasciata y Chamelea striatula en las que un único par era portador de agrupaciones de genes de histonas y de rDNA, y Ruditapes decussatus con señales 5S rDNA y 45S rDNA solapantes. El número y la localización de estas agrupaciones, unido al análisis de las secuencias nucleotídicas de fragmentos del gen de la subunidad I de la citocromo oxidasa (COI) y del rDNA 16S mitocondriales y el espaciador interno transcrito 2 (ITS2) del rDNA 45S nuclear, permitió determinar el estatus taxonómico de las chirlas Chamelea gallina y C. striatula. La comparación de ejemplares procedentes de cuatro poblaciones atlánticas y mediterráneas mostró claras diferencias entre ellas. La constancia en la distribución de las agrupaciones rDNA 5S y la variabilidad en las del rDNA 45S y de los genes de histonas en C. gallina y C. striatula fueron de una magnitud similar a las de Venus casina y V. verrucosa y las de Dosinia exoleta y D. lupinus. Al contrario, aunque se detectaron pequeñas diferencias intraespecíficas tanto en C. gallina como en C. striatula éstas fueron mucho menores que entre taxones y similares a las mostradas por otras especies de bivalvos. La comparación de las secuencias nucleotídicas confirmó que estos taxones son especies diferentes. En Mactridae las agrupaciones 45S rDNA son subterminales en las tres especies. Tanto Spisula solida como Mactra stultorum presentaron dos agrupaciones para el 45S rDNA en los brazos cortos de los pares 17 and 19 y en los brazos largos de los pares 3 y 4, respectivamente. La única agrupación encontrada en Spisula subtruncata se encuentra en el brazo largo del par 18. Las tres mactras presentan una única agrupación 5S rDNA, subterminal en el brazo corto del par 5 en Spisula solida y en el brazo largo del par 3 en Spisula subtruncata, e intercalar en el brazo corto del par 15 en Mactra stultorum. A pesar de que también hay una única agrupación de genes de histona H3 en las tres especies, sus localizaciones difieren, intercalar en el brazo largo del par subtelocéntrico 8 en Spisula solida y del 12 en Mactra stultorum pero subcentromerico en el brazo largo del par metacentrico 14 en Spisula subtruncata. Las coquinas presentaron agrupaciones de genes de la histona H3 intercalares en el brazo largo del par 17, subtelocentrico en D. trunculus y telocentrico en D. vittatus. El rDNA 45S es intercalar en el brazo corto del par 6, subtelocéntrico en D. trunculus. La mayoría de los ejemplares de D. vittatus presentan el rDNAs 45S en el brzo corto del par 6 que en este caso es telocéntrico. Por el contrario, el rDNA 45S es subcentromerico en el brazo largo del par 6, metacéntrico, en todos los especímenes de D. vittatus recolectados en Samil. El número de agrupaciones rDNA 5S es diferente en D. trunculus y D. vittatus. En ambas especies hay una agrupación subterminal en el brazo largo del par subtelocéntrico 10 pero D. trunculus presenta también una segunda agrupacion en el brazo corto del par metacéntrico 2. Las diferencias cariotípicas pudieran ser fundamentalmente debidas a inversiones pericéntricas. Como en las otras familias, las telinas también presentaron diferencias en número y localización de las agrupaciones rDNA 45S, rDNA 5S y de genes de la histona H3. Macomangulus tenuis, Moerella donacina y Bosemprella incarnata portan un único rDNA 45S mientras que Serratina serrata presenta dos. Con respecto al rDNA 5S, también aparecen especies con una (B. incarnata and S. serrata) o dos (M. tenuis and M. donacina) agrupaciones. Por el contrario, las cuatro especies muestran una única agrupación de genes de la histona H3, aunque situados en lugares diferentes. En las especies de tremátodos digeneos estudiadas, los números diploides variaron desde un mínimo de 2n = 12 en B. bacciger a un máximo de 2n = 22 en P. acanthus. Estos parásitos también mostraron grandes diferencias en la morfología de sus cromosomas. Mientras que los cariotipos de C. lingua y P. acanthus se componen de cromosomas exclusivamente metacéntricos y subtelocéntricos, respectivamente, el resto de los taxones presentó diversas combinaciones de tipos cromosómicos. Todas las especies presentaron una única agrupación del rDNAs 45S y otra del 5S aunque la localización fue diferente. En B. minimus and P. acanthus ambos rDNAs aparecen en pares cromosómicos distintos mientras que en las restantes especies las señales solapan en un único par. Los experimentos mediante FISH también permitieron probar la existencia de regiones DAPI negativas, muy descondensadas, coincidentes con el rDNA 45S. Las señales para el 45S rDNA aparecen en la cromatina condensada que flanquea esas regiones y que no son verdaderos telómeros pues carecen de señales teloméricas. La presencia de regiones subcentroméricas de ese tipo en B. australis, P. carvajali, P. acanthus, C. lingua, M. parvus, y B. bacciger, provoca que una tinción sencilla con DAPI diese números cromosómicos aparentemente superiores a la dotación diploide. En los taxones restantes, B. minimus, M. filiformis, C. longicaudata y D. brusinae, muchas de las metafases mitóticas mostraron constricciones secundarias claramente DAPI negativas que separaban un pequeño fragmento de cromatina del resto del cromosoma. En este estudio también se detectaron de 1 a 19 cromosomas B en los ejemplares de B. bacciger aislados de Ruditapes decussatus. Estos cromosomas metacéntricos supernumerarios presentan señales teloméricas en ambos extremos y se caracterizan por mostrar brazos largos fuertemente teñidos con DAPI, evidentes también en los núcleos interfásicos.

Bivalves are a group of exclusively aquatic mollusks characterized by presenting a laterally compressed body whose soft parts are covered by a shell (Gosling 2015). More than 8500 species are currently accepted (World Register of Marine Species, WoRMS, http://www.marinespecies.org/) and they are distributed worldwide inhabiting marine, brackish and, to a lesser extent, freshwater ecosystems. The class Bivalvia includes a considerable number of species of great economic interest that have been traditionally subjected to extensive exploitation on commercial purposes. Their ecological role is of high relevance as they constitute both the basis of trophic networks and the physical support for the development of numerous benthonic animal species, both vertebrates and invertebrates. Bivalve mollusks also act as intermediary hosts in the life cycle of many digenean trematodes, parasitic metazoans that may have a huge impact on bivalve populations, both natural and cultured. Although the classification of bivalves is a rather controversial subject and recent phylogenetic analyses (Bieler et al. 2014) propose six monophyletic lineages within Bivalvia, WoRMS still utilizes four subclasses, Protobranchia, Pteriomorphia, Paleoheterodonta and Heterodonta. The subclass Heterodonta includes more than two thirds of the extant bivalves, extremely diverse in form, size, anatomy and lifestyle. As molecular phylogenies (Bieler et al., 2014) have verified that some of the orders, superfamilies and families in this group are polyphyletic, bivalve taxonomy is under continuous revision. A good example is the traditional order Veneroida, which, despite including some of the largest families (Veneridae, 680 species; Mactridae 180; Donacidae, 100; Tellinidae, 500), is neither morphologically homogeneous nor monophyletic being, therefore, currently taxonomically questioned (Huber 2010, 2015). Most chromosomal studies in bivalves just described chromosome numbers and, in some cases, karyotypes according to size and morphology (Nakamura 1985; Thiriot-Quiévreux 1994). This kind of analysis led to propose that chromosome numbers were relatively stable within families, 2n = 20 in Ostreidae, 2n = 28 in Mytilidae and Pteridae and 2n = 38 in most of the remaining, including Veneridae (Thiriot-Quiévreux 1994). However, further studies showed that some genera and families included species with different diploid numbers. Nevertheless, this does not appear to be the case in Heterodonta since the vast majority of the species are 2n = 38. In addition, karyotypes are usually characterized by presenting similar chromosomes in terms of size and morphology (Nakamura 1985; Thiriot-Quiévreux 1994, 2002). This homogeneity precludes the unequivocal identification of chromosome pairs and, consequently, interspecific chromosomal homologies deducted from comparing homogenously stained metaphases are quite presumptive. Therefore correct comparisons of veneroid karyotypes require methods that allow accurate chromosome identification; among those, chromosome banding and fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH mapping in bivalves has been mostly restricted to 45S rRNA genes (50 species), 5S rRNA genes (25), core histone genes (15), linker histone genes (6) and telomeric sequences (25) (ThiriotQuiévreux 2002; Leitão and Chaves 2008; Petrović et al. 2009; Pérez-García et al. 2010a, 2010b, 2011, 2014a, 2014b; Bouilly et al. 2010; Carrilho et al. 2011; Hurtado et al. 2011; González-Tizón et al. 2013; Li et al. 2016; García-Souto et al. 2017). FISH mapping, mainly applied in Mytilidae, Ostreidae and Pectinidae, have made possible establishing more reliable karyotypes and identifying some of the chromosomal changes accompanying bivalve evolution (Pérez-García et al. 2014b) but also contributing to a better understanding of their phylogenies. In addition, the application of these techniques has shown that, contrasting the presumed karyotypic conservation provided by classical techniques, important variations can appear. For instance, Atlantic species of oysters differ from their Pacific congeners by the chromosomal location of the 45S rDNA, therefore demonstrating that even apparently highly conserved karyotypes diverge (Wang et al., 2004). On the other hand, some satellite DNAs has been also mapped by FISH in these families (Clabby et al. 1996; Wang et al. 2001; Martínez-Lage et al. 2002; Cross et al. 2005; Odierna et al. 2006; Biscotti et al. 2007; Bouilly et al. 2008; López-Flores et al. 2010; Hu et al. 2011; Petraccioli et al. 2015). As for Heterodonta, chromosomal mapping is much scarcer. To date, 45S rDNAs have been located by FISH in 18 species, 5S rDNAs in 9, core histone genes in 2 and telomeric sequences in 12 (Insua et al. 1999; González-Tizón et al. 2000; Wang and Guo 2001, 2007, 2008; Martínez et al. 2002; Plohl et al. 2002; Fernández-Tajes et al. 2003, 2008; Hurtado and Pasantes 2005; Petrović et al. 2009; Bouilly et al. 2010; Carrilho et al. 2011; Hurtado et al. 2011; González-Tizón et al. 2013; Pérez-García et al. 2014a). Almost all species are 2n = 38 and present rather similar karyotypes but considerable differences in the chromosomal distribution of those sequences, thus demonstrating their potential as cytogenetic markers for deducing their evolutionary relationships. Regarding satellite DNAs, they have been only mapped in the manila clam, Ruditapes philippinarum (Passamonti et al. 1998) and the abrupt wedge shell, Donax trunculus (Petrović et al. 2009). Cytogenetic studies in digenean trematodes are even scarcer than in bivalves. Despite being the largest group of metazoan endoparasites comprising more than 18000 extant species, chromosomal numbers and karyotypes have been described in only 300 and FISH mapping was limited to 45S rDNAs and/or telomeric sequences in nine (Hirai et al. 1989, 2000; Baršiené 1993; Hirai y Lo Verde 1996; Bell et al. 1998; Petkevičiūtė et al. 2003; Špakulová and Casanova 2004; Reblánová et al. 2011; Zadesenets et al. 2012a, 2012b; Petkevičiūtė et al. 2012, 2014, 2015; Hirai 2014; Sofi et al. 2015). Therefore, in order to improve our cytogenetic knowledge in both species of the order Veneroida and some of the digenean trematodes that parasite them, we analyzed the chromosomes of 20 bivalve species belonging to the families Veneridae (Ruditapes philippinarum, R. decussatus, Venerupis corrugata, Clausinella fasciata, Chamelea gallina, C. striatula, Venus verrucosa, Venus casina, Dosinia exoleta, Dosinia lupinus and Petricola litophaga), Mactridae (Spisula subtruncata, S. solida and Mactra stultorum), Donacidae (Donax trunculus and D. vittatus) and Tellinidae (Bosemprella incarnata, Macomangulus tenuis, Moerella donacina and Serratina serrata) and 10 taxa of digenean parasites Bucephalus minimus, B. australis, Prosorhynchoides carvajali (Bucephaloidea), Monascus filiformis (Gymnophalloidea), Parorchis acanthus (Echinostomatoidea), Cryptocotyle lingua (Opisthorchioidea), Cercaria longicaudata, Monorchis parvus (Monorchioidea), Diphterostomum brusinae, and Bacciger bacciger (Microphalloidea) isolated from 12 molluskan intermediate hosts. We mostly applied diverse combinations of base-specific (4’-6-diamidino-2-phenylindole DAPI, AT-rich; chromomycine A3, CMA, GC-rich) and unespecific (propidium iodide, PI) fluorochromes, C-banding and 5-methyl-cytosine immunodetection and mapped repetitive DNA probes (45S and 5S rDNAs, core histone genes, telomeric sequences and satellite DNAs) to their chromosomes. Chromosome preparations were obtained following previously published methods (Méndez et al. 1990; Pasantes et al. 1990). After exposing the bivalves overnight to colchicine, gills and gonads were removed, treated with 50% and 25% sea water and fixed in ethanol/acetic acid. Isolated digenean paralarvae were also immersed in 50% and 25% seawater and fixed in ethanol/acetic acid. Fixed samples were disaggregated in 60% acetic acid and the resulting cellular suspensions were dropped onto slides preheated to 50 °C. Fluorochrome staining was performed as described by Pérez-García et al. (2010b). After controlling the quality of the chromosome preparations by phase contrast microscopy (Nikon), selected slides were stained for 2 h with CMA (0.25 mg/mL), counterstained with DAPI (0.14 g/mL) for 8 min, washed in tap water, air-dried and mounted with antifade (Vectashield, Vector). Slide visualization and photography were performed using a Nikon Eclipse-800 microscope equipped with an epifluorescence system. Separated images for each fluorochrome were obtained with a DS-Qi1Mc CCD camera (Nikon) controlled by the NIS-Elements software (Nikon). Merging of the images was performed with Adobe Photoshop. Following visualization and photography, chromosome preparations were re-stained with a combination of DAPI and PI (0.07 g /mL), washed in tap water, air-dried, mounted in antifade, and photographed again. DNA was extracted either using standard chloroform/isoamyl alcohol or the EZNA Mollusc DNA Kit (OMEGA). When necessary, fragments of the mitochondrial COI gene were amplified by PCR employing the standard barcoding primers LCO1490 and HCO2198 (Folmer et al. 1994). The fragments of the mitochondrial 16S rRNA gene were amplified by means of primers 16L29 (Schubart et al. 2001) and 16SBr (Palumbi 1996). The complete ITS2 of the major rDNA was amplified using primers ITS3 and ITS4 (White et al. 1990). On FISH mapping purposes, universal primers LR10R and LR12 retrieved from Vilgalys lab website (http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm) were used to amplify a fragment of the 28S rDNA. Amplifications of the entire 5S rDNA repeat and the H3 histone gene used primers described by Pérez-García et al. (2010a, 2010b) and Giribet and Distel (2003), respectively. DNA sequences were amplified in a GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems) in 50 µL solutions containing 125 ng of genomic DNA, 50M each dNTP, 50 M each primer, 1xPCR buffer, 15 M MgCl2 and 5 U of JumpStart™ Taq DNA Polymerase (Sigma). Amplifications included an initial denaturation step at 95 ºC (2 min), 35 amplification cycles and a final extension at 72 °C (5 min). PCR products were examined by electrophoresis on 2% agarose gels. The amplified sequences were purified (FavorPrepTM GEL/PCR Purification Kit, Favorgen) and sequenced (CACTI, University of Vigo) in both directions in an ABI PRISM 3730 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) using a BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). The sequences were edited with BioEdit v. 7.1.11 (Hall 1999) and aligned with Muscle set to default parameters using MEGA7 (Kumar et al. 2016). Sequence similarity searches were performed using the Basic Local Alignment Search Tool algorithm (BLAST), available at the National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). The MegaBLAST algorithm set to default parameters was employed against both NCBI nucleotide collection and Barcode of Life Data System (BOLD) databases. Metaphase chromosome spreads were single, double and sequentially hybridized using 5S and 45S rDNA and H3 histone gene probes (Pérez-García et al. 2011). 45S rDNA probes were labeled with biotin-16-dUTP (Roche Applied Science) and/or digoxigenin-11-dUTP (10x DIG Labeling Mix, Roche Applied Science) using a nick translation kit (Roche Applied Science). Histone H3 gene and 5S rDNA probes were directly labeled by PCR either with biotin-16-dUTP (20 M) or digoxigenin-11-dUTP (5 M). Chromosome preparations were digested with RNase and pepsin before denaturation (70 ºC, 2 min) and hybridized overnight at 37 ºC. Biotin was detected with fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated avidin and biotinylated anti-avidin (Vector) whereas digoxigenin was detected with antidigoxigenin antibodies conjugated with tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) (Sigma). Chromosome preparations were counterstained with DAPI, mounted with antifade and examined by fluorescence microscopy. Separated images for each fluorochrome were recorded, pseudo-colored and merged as indicated above. In addition, we also performed FISH with a telomeric (C3TA2)3 peptide nucleic acid (PNA) probe (Applied Biosystems) following the protocol indicated by the supplier. Chromosome counting and karyotype analysis were performed in at least 10 specimens per species (5 males, 5 females). For each species, at least 10 complete metaphase plates showing FISH signals were used to construct karyotypes. Chromosome and arm lengths were carefully measured and relative lengths and centromeric indices calculated. In concordance with previous data, all Veneroida species studied herein were 2n = 38 and their karyotypes mostly presented chromosomes showing an almost continuous gradation of decreasing lengths. In 16 of the 20 species GC-rich regions were limited to NORs but in the remaining four, the Donacidae Donax trunculus and D. vittatus and the Mactridae Mactra stultorum and Spisula subtruncata, additional, mostly intercalary, GC-rich heterochromatic bands were present. Moreover, a novel satellite DNA was identified as the major component of this GC-rich heterochromatin in S. subtruncata. As foreseen by the satellite DNA library hypothesis, this satellite DNA was also present in M. stultorum and S. solida, showing a highly conserved nucleotide sequence but a dramatic diminution in the number of repeats. The methylation status of this satellite was explored by both bisulfite genomic sequencing and immunodetection and the results were compared with those of the whole genome, as detected by methylation-sensitive amplification polymorphism (MSAP) and Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assays (ELISA), showing a methylation level that was high for bivalve standards and triplicated the mean methylation of S. subtruncata genome. In regards to FISH mapping data, the distribution patterns of H3 histone gene, 5S rDNA and 45S rDNA clusters in Veneroida showed some peculiarities. In the family Veneridae a total of 18 loci for histone H3 gene clusters were identified in the 11 species analyzed. Six of the species displayed a single core histone gene cluster whilst Chamelea striatula showed four clusters and the remaining four species presented two. Fifteen of these histone gene clusters were subterminal, two were intercalary, and the remaining one subcentromeric. A single major rDNA cluster was present in all venus clams but Chamelea striatula that showed two. In contrast, single 5S rDNA clusters were detected in five of the species, two in other five and three in the remaining one, Petricola litophaga. The signals were on different chromosome pairs but in Clausinella fasciata and Chamelea striatula that showed a chromosome bearing both histone gene and rDNA clusters, and Ruditapes decussatus that presented overlapping 5S rDNA and 45S rDNA signals. The number and location of these clusters, together with the analysis of the nucleotide sequences of fragments of the mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I (COI) and 16S rDNA and the whole nuclear internal transcribed spacer 2 (ITS2), allowed us to elucidate the taxonomic status of the striped venus clams Chamelea gallina and C. striatula. The comparison of four geographically distant Atlantic and Mediterranean populations demonstrated clear differences in the number and distribution of rDNA and histone gene clusters. The consistency in the 5S rDNA signal pattern and the mapping differences for both 45S rDNA and H3 histone gene signals found between C. gallina and C. striatula were of a similar magnitude to those for Venus casina and V. verrucosa and Dosinia exoleta and D. lupinus. Conversely, even though some mapping differences among C. gallina populations and among C. striatula specimens were also found, they were comparatively narrower than those between taxa and similar to those found in other bivalve species; thusly constituting the standard intraspecific variation. The sequence data obtained also indicated that these two taxa are separated species. In the family Mactridae, FISH experiments employing 45S rDNA probes demonstrated that major rDNA clusters were located at subterminal regions in the three species studied. Both Spisula solida and Mactra stultorum showed two 45S rDNA signals, subterminally located on the short arms of two chromosome pairs 17 and 19 and on the long arms of chromosome pairs 3 and 4, respectively. In contrast, a single 45S rDNA cluster was detected on the long arms of chromosome pair 18 in Spisula subtruncata. All three trough shells showed a single 5S rDNA cluster subterminal on the short arms of chromosome pair 5 in Spisula solida and on the long arms of chromosome pair 3 in Spisula subtruncata, and intercalary on the short arms of chromosome pair 15 in Mactra stultorum. Although H3 histone gene clusters also mapped to a single locus in the three analyzed species, their locations differed and were intercalary to the long arms of subtelocentric chromosome pairs 8 in Spisula solida and 12 in Mactra stultorum but subcentromeric to the long arms of metacentric chromosome pair 14 in Spisula subtruncata. Donacidae wedge shell species displayed H3 histone gene clusters intercalary to the long arms of chromosome pair 17 but this chromosome was subtelocentric in D. trunculus and telocentric in D. vittatus. 45S rDNAs mapped to a single locus intercalary to the short arms of subtelocentric chromosome pair 6 in D. trunculus. Most D. vittatus specimens also displayed major rDNAs in the short arms of chromosome pair 6, telocentric. In contrast, 45S rDNA is subcentromeric to the long arms of chromosome pair 6, metacentric, in all D. vittatus specimens collected in Samil. The number of 5S rDNA clusters displayed by D. trunculus and D. vittatus was different. Whilst subterminal signals on the long arms of a single subtelocentric chromosome pair were present in the two wedge shells, D. trunculus presented an additional signal intercalary to the short arms of metacentric chromosome pair 2. The intraand interspecific karyotype differences seem to be the results of multiple pericentric inversions. As for the other veneroid families, tellin clams also showed interspecific divergences in the number and location of 45S rDNA, 5S rDNA and H3 histone gene clusters. Bosemprella incarnata, Macomangulus tenuis and Moerella donacina displayed a single 45S rDNA cluster, whilst Serratina serrata presented two. One (B. incarnata and S. serrata) or two (M. tenuis and M. donacina) 5S rDNA clusters were also present in these species. In contrast, all four tellin clams showed single H3 histone gene clusters, although at different locations. In the digenean trematode species studied, diploid numbers varied from a minimum of 2n = 12 for B. bacciger to a maximum of 2n = 22 for P. acanthus. They also showed striking differences in chromosome composition. Whereas C. lingua and P. acanthus karyotypes were exclusively composed of exclusively metacentric and subtelocentric chromosomes, respectively, the remaining taxa presented diverse combinations of chromosome types. Single- and double-color FISH experiments demonstrated the presence of both 45S and 5S rDNA clusters at a single locus in all taxa, but displaying differences in chromosomal location. In B. minimus and P. acanthus 45S and 5S rDNA clusters were located on different chromosome pairs, whilst the remaining species showed overlapping signals at a single location on one chromosome pair. FISH mapping also demonstrated the presence of highly uncondensed, DAPI negative unstained regions coincident with major rDNA signals. 45S rDNA signals appeared at the condensed chromatin at both sides of the uncondensed regions but without any sign of telomeric signals. These regions were subcentromeric in B. australis, P. carvajali, P. acanthus, C. lingua, M. parvus, and B. bacciger, thus yielding apparently higher chromosome numbers than its species respective modal number after DAPI staining. In the remaining taxa, B. minimus, M. filiformis, C. longicaudata and D. brusinae, many of the metaphase plates showed clear DAPI-negative secondary constrictions that separated relatively small pieces of chromatin from the chromosome. This approach also allowed for the detection of B chromosomes on B. bacciger isolated from Ruditapes decussatus from a minimum of 1 to a maximum of 19 per metaphase plate. These supernumerary metacentric chromosomes presented telomeric signals at both ends and were characterized by showing long arms strongly stained with DAPI also evident on the interphase nuclei.