Implementation of new strategies for mutational and functional characterization of families with clinically suspected Bardet-Biedl syndrome

Abstract

O principal obxectivo deste estudio será a identificación e posterior caracterización das mutacións responsables da patoloxía en pacientes con diagnóstico clínico de síndrome de Bardet-Biedl, tanto in silico como in vivo no modelo animal do peixe cebra, así como tratar de establecer una correlación xenotipo-fenotipo nesta síndrome. Ademais, empregaranse as novas ferramentas de secuenciación masiva para axilizar o diagnóstico e a proposta de novos xenes candidatos. Os cilios e flaxelos son estruturas subcelulares que sobresaen das superficies de moitos tipos celulares en organismos eucarióticos. Estas estruturas están presentes en diferentes tipos de tecidos e organismos, e están involucrados en funcións como a actividade sensorial, motilidade celular, transporte molecular, e tamén en varios procesos do desenvolvemento como o establecemento do eixe de simetría esquerdo-dereito en vertebrados. Os cilios son, polo tanto, uns orgánulos complexos que abranguen máis de 300 proteínas e que facilitan a realización dunha serie de funcións celulares tanto sensoriais coma motoras. Os defectos nos cilios asócianse cunha lista cada vez maior de enfermidades raras xenéticas denominadas ciliopatías, entre as que se inclúen a enfermidade poliquística de ril (PKD), a síndrome de Bardet-Biedl (BBS), a síndrome de Alström (ALMS), a síndrome de Joubert (JBS) e a síndrome de McKusick-Kaufman (MKKS), entre outras. As ciliopatías son un grupo de patoloxías que se caracterizan por unha grande heteroxeneidade tanto clínica coma xenética e un gran solapamento fenotípico entre elas, feito que en xeral complica a súa diagnose. Ata o momento describíronse mutacións en moitos xenes relacionados coas distintas patoloxías; un mesmo xene parece estar involucrado en varias enfermidades de tipo ciliar, ás veces como axente causal, outras veces coma modulador da expresión fenotípica. De entre todas as ciliopatías, este estudo céntrase principalmente na síndrome de Bardet-Biedl (SBB), unha enfermidade heteroxénea causada por un amplo espectro de síntomas, que inclúen distrofia de retina, obesidade, polidactilia, anomalías renais, disfunción cognitiva e hipogonadismo, entre outras. As mutacións nos xenes relacionados están vencelladas a unha cilioxénese defectiva e/ou unha disfunción ciliar. Esta síndrome presenta, normalmente, un modo de herdanza autosómica recesiva, pero nos últimos anos coñecéronse cada vez máis casos de herdanza oligoxénica. Dentro de todo o conxunto de proteínas BBS, oito delas (BBS1, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS8, BBS9, BBS18) constitúen un complexo multiproteico denominado BBSoma, involucrado no tráfico de proteínas e vesículas a través dos microtúbulos. As mutacións presentes ata o de agora nos xenes que codifican estas oito proteínas supoñen aproximadamente un 43% da carga mutacional total atribuida ós xenes BBS. De entre eles, o BBS1 é o xene predominantemente mutado, cuxa mutación p.M390R e a máis frecuente en pacientes con SBB. A proteína codificada por este xene xoga un papel fundamental na bioxénese da membrana ciliar, así como en diversas vías de sinalización. A caracterización da carga mutacional total nos afectos da síndrome levarase a cabo mediante diversas ferramentas xenéticas (secuenciación directa, mapeo de homocigosidade e secuenciación masiva), e tratarase de establecer una correlación xenotipo-fenotipo coas variantes achadas. Para una pequena selección de variantes potencialmente patoxénicas identificadas en xenes BBS, realizarase a súa caracterización funcional in vivo empregando o modelo animal do peixe cebra. Trátase dun modelo de uso estendido na actualidade dada a súa similitude co xenoma humano (≈75%), fácil manexo, transparencia e rápido desenvolvemento, entre outras vantaxes. Empregarase a secuenciación de exoma completo para o diagnóstico dunha selección de pacientes con sospeita clínica de BBS, nos que previamente se descartaron mutacións nos xenes BBS predominantes. Esta técnica permitirá analizar toda a rexión codificante do xenoma de forma máis rápida e eficaz, de aí o seu uso cada vez máis frecuente na práctica clínica para o diagnóstico molecular. Unha das vantaxes destas técnicas de secuenciación masiva é a capacidade de identificar novos xenes candidatos que, tras realizar estudios funcionais en liñas celulares ou modelos animais, poderían asociarse a esta patoloxía ou, en xeral, a una enfermidade ciliar.