Desde los comienzos de la agricultura, el control de malezas ha sido clave para la producción vegetal, ya que éstas compiten con el cultivo principal por los recursos, convirtiéndolas en uno de los principales factores limitantes de la productividad. Esto ha llevado al desarrollo y uso masivo de los fitosanitarios de síntesis, lo que ha contribuido notablemente a la contaminación y al deterioro de los agroecosistemas. En consecuencia, la legislación europea (EC 1107/2009) ha eliminado del mercado algunos productos o ingredientes activos considerados perjudiciales para el medio ambiente. En el caso de la Agricultura Ecológica (AE), donde se prohíbe el uso de fertilizantes y fitosanitarios de síntesis (EC 834/2007), la carencia de insumos apropiados para ciertos usos es todavía más preocupante, lo que hace que los agricultores ecológicos deban recurrir necesariamente a otros métodos de control de malezas. Este trabajo de Tesis Doctoral titulado “Eucalyptus globulus Labill. for weed control in Organic Agriculture: from molecules to the field” nace como respuesta a la demanda de herramientas eficientes para el control de malas hierbas en AE, pero también a la agricultura convencional, en la búsqueda de nuevas alternativas a los herbicidas convencionales de síntesis, como herramientas complementarias, o incluso únicas, para una producción agrícola de calidad sostenible, saludable, y más respetuosa con el medio ambiente. En la búsqueda de nuevos bioherbicidas, la utilización de las interacciones químicas entre plantas se presenta como una de las estrategias alternativas para el control de malezas. Las sustancias (aleloquímicos) que liberan las plantas en su entorno pueden interferir en la germinación y el crecimiento de las plantas “adversarias”. Está demostrado que bajo condiciones naturales, los aleloquímicos liberados actúan de forma sinérgica y ejercen su efecto inhibitorio como mezclas complejas. Por tanto, material vegetal y extractos crudos de nuevas especies con capacidad alelopática podrían ser utilizados como cócteles naturales de aleloquímicos con efecto bioherbicida que, bajo determinadas condiciones y debidamente dosificados, y al ser aportados al suelo como abonos verdes o aplicados sobre las malas hierbas, controlasen su germinación y/o crecimiento. En los sistemas agroforestales de la Península Ibérica, existe una enorme variedad de plantas silvestres, biomasa y co-productos forestales, que tienen potencial para convertirse en herramientas apropiadas para el control de malezas. De este modo, surge la pregunta ‘¿Y si, en lugar de cultivar un abono verde alelopático, se aportase como tal Eucalyptus globulus Labill. for weed control in Organic Agriculture: from molecules to the field ii biomasa con potencial bioherbicida disponible en el agroecosistema?’. El servicio agroecosistémico del control de malezas se llevaría a cabo mediante un uso eficiente de los recursos agroforestales, facilitando el reciclado de nutrientes y sin ocupar tiempo ni espacio en la hoja de cultivos, y por tanto, optimizando el rendimiento agrícola. El Capítulo 1 de esta Tesis describe la situación e importancia de la AE en los últimos años, así como el uso potencial de especies alelopáticas para el control de malezas y las evidencias alelopáticas de E. globulus recogidas en la literatura científica que justifican el presente estudio. El objetivo general de este trabajo (Capítulo 2) es caracterizar el potencial fitotóxico y las dosis activas del extracto acuoso y abono verde a base de filodios de eucalipto, así como evaluar su efectividad como bioherbicida e identificar los posibles compuestos responsables de los efectos observados. Para alcanzar este objetivo general, se establecieron una serie de objetivos específicos, los cuales se llevaron a cabo mediante ensayos de laboratorio, invernadero y campo desarrollados en los cuatro capítulos que se resumen a continuación. En el Capítulo 3, titulado “Valorization of agroforest species as bioherbicides” (Valorización de especies agroforestales como bioherbicidas), se evaluó el potencial fitotóxico de los extractos acuosos de quince especies agroforestales sobre la germinación y el crecimiento de la especie modelo dicotiledónea Lactuca sativa y de la monocotiledónea Agrostis stolonifera, con el fin de seleccionar la especie más prometedora. Aunque la mayoría de los extractos mostraron efectos fitotóxicos similares o mayores que el herbicida sintético de preemergencia metolacloro (usado como control positivo), Eucalyptus globulus fue seleccionada como la especie más prometedora para el control de malezas en AE. Además, evidencias previas de su actividad alelopática, junto con la abundancia de biomasa presente en el sistema agroforestal derivada de las plantaciones destinadas a la industria papelera, nos llevó a plantearnos un uso potencial de los residuos forestales de eucalipto como bioherbicida. Para ello, se llevaron a cabo ensayos in vitro con el fin de caracterizar el extracto acuoso de filodios de E. globulus mediante (i) la evaluación de su efectividad en preemergencia sobre la germinación y crecimiento de las especies modelo, obteniendo las pautas dosis/respuesta y concentraciones de inhibición ED50 y ED80, (ii) la evaluación de su efectividad en pos-emergencia sobre parámetros fisiológicos (fotosíntesis, contenido Resumen iii de clorofilas y proteínas) y morfológicos (biomasa aérea y su relación ps/pf, y biomasa y longitud de raíz) de plantas adultas de L. sativa, y (iii) el análisis cualitativo y cuantitativo por HPLC-DAD/UV de los compuestos potencialmente alelopáticos presentes en el extracto acuoso. Los resultados mostraron una clara relación dosis/respuesta sobre la germinación y crecimiento temprano de las especies modelo. Sin embargo, la ausencia de efectos fitotóxicos sobre plantas adultas de lechuga, escogida como especie modelo por su alta sensibilidad a los aleloquímicos, nos llevó a descartar el uso del extracto acuoso de eucalipto como bioherbicida de pos-emergencia, ya que estos efectos serían agronómicamente irrelevantes en el contexto del control de malezas. El análisis químico del extracto acuoso reveló la presencia de 8 compuestos fenólicos y 5 ácidos orgánicos, demostrando la capacidad de las hojas de eucalipto de liberar aleloquímicos al medio ambiente. La mayoría de los compuestos identificados han sido reconocidos por otros autores como sustancias fitotóxicas. No obstante, aunque muchas especies sean capaces de producir aleloquímicos, éstos podrían ser rápidamente degradados por los microorganismos edáficos o por otras interacciones que tienen lugar en el suelo, convirtiendo a estas sustancias en moléculas no tóxicas, o reduciendo su fitotoxicidad sobre las especies diana. Por ello, uno de los mayores desafíos que nos encontramos a la hora de aplicar el uso de extractos acuosos o aceites esenciales para el control de malezas, suele ser la obtención de un efecto fitotóxico a largo plazo. En este sentido, el uso de plantas alelopáticas incorporadas al suelo como abono verde sería una buena estrategia para conseguirlo, especialmente el uso de aquellas con tasas bajas de descomposición, como es el caso del eucalipto, lo que conllevaría la capacidad de liberar lentamente los aleloquímicos. Todo esto contribuyó al diseño de los experimentos de invernadero, desarrollados en el Capítulo 4 de esta Tesis. En este Capítulo 4, titulado “Eucalyptus globulus leaves incorporated as green manure for weed control in maize: greenhouse experiments” (Filodios de Eucalyptus globulus incorporados como abono verde para el control de malezas en maíz: experimentos de invernadero), se comprobó la efectividad de las hojas de eucalipto incorporadas al suelo como abono verde sobre la germinación y crecimiento temprano del maíz y de las especies arvenses más problemáticas asociadas a este cultivo, con el fin de establecer pautas preliminares para su manejo como abono verde en ensayos de campo. Previamente, en ensayos in vitro, se evaluó el potencial fitotóxico del extracto acuoso de eucalipto sobre las especies diana de malas hierbas Amaranthus retroflexus y Echinochloa crus-galli, y sobre el maíz. Mediante curvas dosis/respuesta, se obtuvieron las concentraciones de inhibición ED50 y ED80 del extracto para las tres especies, permitiendo establecer la concentración en el suelo óptima para el control de las malas hierbas en los posteriores ensayos de maceta. El extracto acuoso fue capaz de inhibir la germinación de A. retroflexus y de reducir el crecimiento de E. crus-galli, sin llegar a afectar al desarrollo del maíz. Una vez esclarecido el potencial bioherbicida de preemergencia del extracto acuoso de eucalipto sobre las especies diana, y establecida la dosis necesaria en suelo para el control de malezas, se llevaron a cabo dos experimentos en maceta bajo condiciones de invernadero. En el primer experimento, las hojas de eucalipto se incorporaron al suelo en dos dosis diferentes, 1% y 2% (proporción de peso seco de hojas por peso seco de suelo), con el fin de evaluar el efecto fitotóxico del eucalipto sobre la germinación, establecimiento y crecimiento temprano del maíz y de las especies arvenses más problemáticas asociadas a este cultivo. Treinta días después de la incorporación del eucalipto como abono verde, se observaron reducciones de la biomasa aérea, tanto de las especies de malas hierbas dicotiledóneas como monocotiledóneas, con un efecto similar entre ambas dosis. El hecho de que la dosis más baja fuera igualmente efectiva que la dosis más alta, nos llevó a seleccionar la primera como la óptima para controlar las malezas en los siguientes ensayos de campo, reduciéndose así la carga de trabajo y los costes. En el segundo experimento de maceta, se evaluó el efecto fitotóxico temporal del abono verde a base de eucalipto con el fin de determinar la duración del efecto sobre la germinación y el crecimiento temprano del maíz y de dos especies diana de malas hierbas. Los resultados obtenidos mostraron inhibición de la germinación y del crecimiento de la dicotiledónea A. retroflexus en todos los tiempos ensayados. Sin embargo, el abono verde de eucalipto no pudo controlar la monocotiledónea E. crus-galli. Se observó reducción de la biomasa aérea del maíz al inicio del ensayo, dando lugar al establecimiento de un periodo de seguridad para la siembra del maíz de 12 a 15 días tras la incorporación del eucalipto al suelo, que posteriormente se adoptó en los experimentos de campo. Según estos resultados, se estableció la hipótesis de un modelo de dos fases en la dinámica de los efectos del eucalipto sobre el crecimiento del maíz. La primera fase, correspondiente a un periodo inhibitorio de 12 días tras la incorporación del eucalipto, se relacionó con la acumulación de compuestos volátiles en la atmósfera del suelo. Esta Resumen v ‘fase volátil’ daría paso a una fase estimulatoria o ‘fase soluble’, relacionada con el principio de la descomposición del material vegetal y con la liberación de nutrientes al suelo. Hasta ahora, se había demostrado la actividad fitotóxica del abono verde a base de hojas de eucalipto. Sin embargo, cuestiones como ‘¿Qué está ocurriendo exactamente a nivel químico?’ o ‘¿Cuáles son los compuestos potencialmente responsables de los efectos fitotóxicos observados en los ensayos de maceta?’ seguían sin resolver. Para responder a estas preguntas, se llevaron a cabo ensayos in vitro desarrollados en el Capítulo 5, titulado “The consistency between phytotoxic effects and the dynamics of allelochemicals release” (Consistencia entre los efectos fitotóxicos y la dinámica de liberación de aleloquímicos). El objetivo de este capítulo fue validar el modelo de dos fases hipotetizado en los ensayos previos, a través del estudio del efecto del suelo en la evolución de los compuestos alelopáticos tras la incorporación del material vegetal. Se realizaron análisis secuenciales de fenoles y flavonoides por HPLC-DAD y de compuestos volátiles por HS-SPME/GC-IT-MS, junto con bioensayos in vitro de ambas fracciones soluble y volátil sobre la germinación y crecimiento de la especie modelo. Los resultados de este capítulo esclarecieron los patrones de la dinámica de fitotoxicidad y liberación de aleloquímicos durante el proceso de descomposición de las hojas de eucalipto incorporadas al suelo durante 30 días. El análisis químico reveló la presencia de 6 compuestos fenólicos y 10 compuestos volátiles, siendo el eucaliptol el compuesto mayoritario. Según los resultados obtenidos, tanto los compuestos fenólicos como volátiles mostraron una liberación continua y simultánea durante todo el periodo de descomposición de las hojas en el suelo, rechazando la hipótesis del modelo de dos fases descrito previamente. La fracción soluble pudo inhibir la germinación de la especie modelo L. sativa a lo largo del tiempo, pero no afectó a su crecimiento. Esta observación podría estar relacionada con la inhibición continua de la germinación de A. retroflexus observada en el ensayo temporal de macetas del Capítulo 4. Por otro lado, la fracción volátil no pudo inhibir la germinación de la especie modelo, sin embargo su crecimiento se vio afectado durante todo el periodo ensayado. Esto podría explicar las reducciones del crecimiento de E. crus-galli y maíz a medio plazo, observadas en el primer experimento de macetas del capítulo anterior. Hay que tener en cuenta que estas relaciones son especulativas, ya que el efecto fitotóxico de cada tipo de compuesto sobre ambos procesos (germinación y crecimiento) se ha estudiado sobre la especie modelo L. sativa, por lo que estos efectos podrían no ser extrapolables a otras especies diana. Cabe señalar que, tanto los compuestos fenólicos como volátiles identificados y cuantificados en este trabajo fueron obtenidos mediante métodos de extracción ‘natural’, ya que en todos los análisis químicos se usó agua destilada como disolvente de extracción para los compuestos solubles, o técnicas donde se extraen y detectan solo aquellos volátiles que se liberan en la atmósfera (headspace trapping techniques). Es probable que, por esta razón, el número de compuestos obtenidos en este estudio haya sido menor en comparación con otras referencias en la literatura científica, donde usan métodos de extracción de alto rendimiento. Por tanto, cabe suponer que los compuestos identificados en este trabajo son los que realmente se encuentran en la atmósfera del suelo. Finalmente, en el Capítulo 6 titulado “On the suitability of Eucalyptus globulus green manure for field weed control” (Sobre la adecuación de Eucalyptus globulus como abono verde para el control de malezas en campo) se llevaron a cabo experimentos de campo. Los objetivos de este capítulo fueron demostrar la eficacia bioherbicida de los residuos de eucalipto incorporados al suelo como abono verde en parcelas experimentales, mediante la descripción de sus efectos sobre la diversidad y abundancia de la flora arvense y sobre parámetros agronómicos del cultivo, así como evaluar el efecto del eucalipto sobre las propiedades físico-químicas y microbiológicas del suelo a lo largo del ensayo. Los experimentos se llevaron a cabo en dos localidades distintas durante dos años consecutivos. Los resultados obtenidos demostraron la capacidad del eucalipto incorporado como abono verde para reducir la biomasa de las especies de malas hierbas dicotiledóneas y monocotiledóneas, en ocasiones llegando a mostrar igual efectividad que la escarda manual. Y, a pesar de ser campos de experimentación con una alta infestación de malas hierbas, se obtuvieron valores de biomasa de maíz superiores a las parcelas control. Los análisis sobre las propiedades físico-químicas y microbiológicas del suelo mostraron que los restos de eucalipto incorporados como abono verde no producen efectos negativos sobre la calidad del suelo. Derivadas de la “Discusión general” realizada en el Capítulo 7 (General discussion), de esta Tesis surgen las siguientes “Conclusiones generales”, que se exponen en el Capítulo 8 (General conclusions): (1) El extracto acuoso de hojas de Eucalyptus globulus reveló efectos fitotóxicos sobre la germinación, el crecimiento y otras variables medidas en especies modelo. A pesar de que se encontraron efectos Resumen vii fitotóxicos sobre algunos parámetros fisiológicos en plantas adultas de lechuga, se descartó el uso del extracto acuoso como bioherbicida de pos-emergencia; sin embargo, su uso como bioherbicida de pre-emergencia se mostró prometedor. Se concluye que E. globulus posee un cóctel de compuestos fitotóxicos (compuestos fenólicos y ácidos orgánicos) que podrían ser liberados por los residuos de hoja incorporados al suelo y, por tanto, interferir en la germinación y desarrollo de otras especies. (2) La combinación de ensayos in vitro con experimentos de maceta sobre los efectos fitotóxicos de las hojas de E. globulus fue muy útil para valorar su uso potencial para el control de malezas en campo. Se establece así una metodología adecuada y novedosa de bioensayos de invernadero en maceta para el estudio del potencial bioherbicida de cultivos y plantas silvestres. Se demuestra que el abono verde a base de filodios de eucalipto tiene capacidad herbicida sobre las especies arvenses Amaranthus retroflexus, Solanum nigrum, Echinochloa crus-galli y Digitaria sanguinalis. Para las especies ensayadas, se describen distintos procesos afectados según sea la especie diana dicotiledónea o monocotiledónea, con la inhibición de la germinación o del crecimiento a medio plazo, respectivamente. Se hipotetiza un modelo de dos fases en función de la dinámica de los efectos fitotóxicos observados sobre el crecimiento del maíz y, por tanto, se recomienda un periodo de seguridad para la siembra del maíz tras el enterramiento del abono verde de entre 12 y 15 días. Los resultados evidencian que la incorporación de hojas de E. globulus al suelo a la dosis más baja, puede ser una práctica viable para el control de malezas en ensayos de campo. (3) El estudio en profundidad del destino de los aleloquímicos presentes en hojas de E. globulus, reveló una dinámica de liberación continua y simultánea de los diferentes compuestos fenólicos y volátiles durante un periodo de 30 días de descomposición, rechazándose así el modelo de dos fases establecido previamente. La obtención de los compuestos fenólicos y volátiles se llevó a cabo mediante métodos de extracción ‘naturales’, llegando a identificar y a cuantificar 6 y 10 compuestos, respectivamente. El uso de esta metodología permite asumir que los compuestos identificados en este trabajo son aquellos que realmente se encuentran presentes en la atmósfera del suelo. La dinámica de liberación de este cóctel de aleloquímicos en el ambiente edáfico puede ser la responsable de los patrones de fitotoxicidad observados en los experimentos de laboratorio e invernadero. Ambos tipos de compuestos tuvieron efectos fitotóxicos durante todo el periodo de ensayo, siendo los responsables de la inhibición de la germinación, en el caso de los compuestos solubles, o de la reducción del crecimiento en el caso de los volátiles. (4) Mediante un estudio integral de campo, se demostró que los residuos de cosecha de E. globulus incorporados al suelo como abono verde ejercieron un control a medio y largo plazo sobre las malas hierbas. El eucalipto pudo reducir significativamente las malas hierbas más dominantes y problemáticas como D. sanguinalis y Chenopodium álbum. Además, mostró una efectividad general sobre las malezas, en ocasiones llegando a ser incluso igual de efectivo que el tratamiento de escarda, lo que implicaría reducciones en carga de trabajo y costes. (5) Los resultados obtenidos sobre las propiedades físico-químicas y microbiológicas del suelo de las parcelas de campo demostraron que el modo de incorporar los residuos de eucalipto como abono verde no deteriora la calidad del suelo. Y, (6) nuestros resultados ofrecen evidencias positivas sobre el uso de residuos de eucalipto incorporados al suelo como abono verde, siendo una herramienta barata, sostenible y respetuosa con el medio ambiente para el control de malas hierbas en producción ecológica de maíz, y potencialmente en otros cultivos tolerantes. Así, también se sugiere su uso como un método para reducir la excesiva dependencia de herbicidas de síntesis en la agricultura convencional. En esta Tesis, el uso de los residuos de Eucalyptus globulus incorporados al suelo como abono verde para el control de malezas ha sido estudiado por primera vez, aportando valor a un sub-producto forestal como recurso para la sostenibilidad de la producción agrícola, especialmente en Agricultura Ecológica.